[发明专利]稳定表达绿色荧光蛋白的骨髓增生异常综合征转白细胞株

说明书

本发明属微生物动物细胞系领域。设计稳定表达绿色荧光蛋白的骨髓增生异常综合征转白细胞株及其建立方法和用途，本发明以人骨髓增生异常综合征转白细胞系SKM‑1为母系细胞，通过携带GFP基因的慢病毒进行转染，以有限稀释法获得GFP阳性的单细胞克隆，并将扩大培养后的细胞通过皮下注射的方式在小鼠体内筛选，致瘤后将瘤块分离，继续培养后，获得稳定表达绿色荧光蛋白的骨髓增生异常综合征转白细胞株SKM‑1/GFP。该细胞系形态和生长特性与母系细胞无差异，生长曲线与母系细胞无差异，可以稳定表达GFP，并且具有致瘤性。可进一步用于小鼠动物模型的建立以及为MDS微小残留病及其他临床前研究提供平。

技术领域

本发明属生物技术、微生物动物细胞系领域，涉及骨髓增生异常综合征转白细胞株，具体涉及一种稳定表达绿色荧光蛋白的骨髓增生异常综合征转白细胞株及其制备方法和用途。

背景技术

现有技术公开了骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndeome,MDS)是一组克隆性细胞异常增生的疾病，以无效造血、病态造血及高风险向急性髓系白血病(AML)转化为特点，其中，约20％-30％的MDS患者向AML进展。据报道，在美国，MDS是最常见的髓系来源的肿瘤，男性发病率高于女性，平均每10⁵个美国人中有3-4人患有MDS；随着年龄的增加，MDS的发病率逐渐增加；在年龄大于60岁的患者中，发病率高达7-35/10万，有研究显示先前行化疗及放疗治疗的患者是MDS发病的高危人群。有统计显示，我国MDS的发病率为1.45/10万，略低于欧美国家，随着我国老龄化进程逐渐加剧，MDS的发病率也呈持续上升状态。基于形态学、分子生物学、细胞遗传学和免疫表型，世界卫生组织(WHO)将MDS分为：难治性血细胞减少症伴单系病态造血(RCUD)、难治性血细胞减少伴多系病态造血(RCMD)、环形铁粒幼细胞性难治性贫血(RARS)、难治性贫血伴原始细胞增多1型(RAEB-1)、难治性贫血伴原始细胞增多2型(RAEB-2)、5q-综合征、不能分类的MDS(MDS-U)。

研究显示，在MDS的早期阶段，造血细胞过度凋亡导致一系或者多系细胞减少。在MDS中细胞遗传学的进一步改变导致造血细胞增殖加速、分化受阻，最终进展为AML。与初发AML(de novo AML)相比，MDS转化的AML(sAML)患者年龄偏大，治疗难度大，常常不能应用异基因造血干细胞移植(Allo-HSCT)和强烈化疗进行治疗，其预后不佳；研究还显示，随着地西他滨及阿扎胞苷等去甲基化药物的研发，治疗MDS的手段取得了突破性进展，但该些药物对高危MDS和sAML的治疗作用有限。由于临床实践缺乏有效的治疗手段，体内的白血病细胞难以清除，最终威胁患者的生命；然而，目前国内外缺乏有效可靠的体内外研究平台，严重制约了MDS的基础及临床前研究。

随着基因标记技术的发展，细胞示踪在肿瘤的研究中得到了越来越多的应用；绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)可以在相应波长的紫外光激发下发出绿色荧光，与传统的新霉素耐药基因(NeoR)和编码大肠杆菌β-半乳糖苷酶的Lac-Z基因标记技术相比，GFP标记肿瘤细胞具有动态直观、操作简便、检测方便、灵敏度高的优点，可以灵敏地显示肿瘤细胞的位置，并进行定量研究，可应用于微小残留病等的研究，而且随着动物活体成像技术的发展，GFP也适合体内细胞的观察；同时，由于其分子量小，GFP可以与其他目的基因表达产物形成融合蛋白，不影响目的蛋白的空间构象和功能，用于目的蛋白的位置标记、功能和定量研究；基于以上几点，以GFP进行细胞示踪为相关的肿瘤的研究提供了新的平台。

微量残留白血病(minimal residual leukemia,MRL)是指白血病经诱导治疗获得完全缓解后体内残留少量白细胞的状态，其是白血病复发的根源；由于微小残留白血病分布隐蔽，通常临床不易检测，成为MRL研究的瓶颈。

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供使GFP高效和稳定地在细胞中表达的技术方案，具体涉及提供一种稳定表达绿色荧光蛋白的骨髓增生异常综合征转白细胞株及其制备方法，进一步用于建立小鼠动物模型，利用荧光在成像上的优势，在动物体内长期观察，明确白血病细胞分布模式；为微小残留病的研究提供平台。