[发明专利]一种酶促合成紫云英苷的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，利用酶促方法合成目标化合物——紫云英 苷，分类号为C12P。

背景技术

紫云英苷是广泛存在于药用植物中的一种天然类黄酮化合物，具有抗炎、抗 氧化、强心、镇痛、抗菌、抗过敏、抗肝毒作用，并能增强机体抵抗力、刺激干 扰素的产生、抗心律失常、扩张血管、保护心肌等作用。尽管紫云英苷具有治疗 人类多种疾病的巨大潜能，然而目前获得紫云英苷的途径相对单一。

国内外的常用获取方法之一是有机溶剂提取法，该方法步骤繁琐复杂、周期 长、得率低、成本高、并且在分离纯化过程中需要用到大量的有机溶剂，加之原 材料的来源易受到季节的限制，因而不利于工业化生产，更不符合绿色化学的发 展要求。以从芍药中提取分离紫云英苷为例，将采集的植物药用部位烘干、粉碎， 甲醇提取三次，用等体积的乙酸乙酯萃取甲醇提取物，然后用硅胶柱层析和 SephadexLH-20凝胶柱层析分离乙酸乙酯萃取物，检测分离的组分，最后得到较 纯的紫云英苷。

获得紫云英苷的另外一种常用方法是化学合成法，该方法的反应条件苛刻， 合成过程复杂，反应催化剂多为有毒物品，且区域选择性差、易产生大量的副产 物、产率低，在反应过程中采用的基团保护、糖基化修饰等增加了反应步骤，使 反应时间延长，引入的试剂增多，尤其是糖苷化的条件极为苛刻，且特异性不高， 不仅增加了分离纯化的难度，更是增加了生产成本，这些不利因素极大地限制了 紫云英苷的工业化生产。例如ToshihiroKumazawa等以多羟基苯乙酮为原料，以 三氟化硼-乙醚作为催化剂将反应温度由-78℃升至-30℃进行糖苷化，合成过程中 容易形成其他单糖苷类和多糖苷类化合物，使得副产物增多，产率下降。

因此，很有必要开发一种获取紫云英苷的新方法来取代现有方法，以促进紫 云英苷的产业化生产和其在医药领域的广泛应用。

发明内容

为了克服现有方法的存在的局限性，本发明提供了一种酶促合成紫云英苷的 方法，该方法具有步骤少、操作条件温和、生产成本低、副产物少、得率高、无 污染、产品分离相对简单、生产周期明显缩短、生产成本显著降低等特点。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种酶促合成紫云英苷的方 法，是以柚皮素NRN和肌糖原Gn为原料，在体外通过酶促反应分别经二氢山 奈酚DHK和葡萄糖-1-磷酸G-1-P制得山奈酚KMF和尿苷二磷酸葡萄糖UDPG， 山奈酚和尿苷二磷酸葡萄糖再通过酶促反应最终制得紫云英苷。

具体地，本发明方法包括如下步骤：

(1)克隆、表达和纯化紫云英苷在合成途经中所需的关键酶，所述关键酶包括 糖原磷酸化酶GP、葡萄糖焦磷酸化酶GalU、黄烷酮-3-羟化酶F3H、黄烷酮合 酶FLS1和类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶UGT78K2；

(2)肌糖原Gn在糖原磷酸化酶GP作用下合成葡萄糖-1-磷酸G-1-P；

(3)葡萄糖-1-磷酸G-1-P在葡萄糖焦磷酸化酶GalU作用下合成尿苷二磷酸葡 萄糖UDPG；

(4)柚皮素NRN在黄烷酮-3-羟化酶F3H作用下合成二氢山奈酚DHK；

(5)二氢山奈酚DHK在黄烷酮合酶FLS1作用下合成山奈酚KMF；

(6)山奈酚KMF和尿苷二磷酸葡萄糖UDPG在类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶 UGT78K2作用下最终合成紫云英苷。

其中，步骤(1)紫云英苷生物合成途经中关键酶的克隆、表达和纯化可采 用下述方法：

分别从拟南芥中克隆黄烷酮-3-羟化酶(F3H)基因f3h和黄烷酮合酶(FLS1) 基因fls1、从新西兰兔中克隆糖原磷酸化酶(GP)基因gp至原核表达载体pET-32a， 构建重组质粒pET-32a-f3h、pET-32a-fls1和pET-32a-gp；克隆黑豆UDP-葡糖糖 的类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶(UGT78K2)基因ugt78k2和大肠杆菌UDP葡萄 糖焦磷酸化酶(GalU)基因galU至原核表达载体pGEX-5X-1，构建重组质粒 pGEX-5X-1-ugt78k2和pGEX-5X-1-gaIU，按常规方法诱导表达和纯化融合蛋白。

在步骤(2)至步骤(5)的紫云英苷的体外逐步合成过程中，具体的工艺条 件和参数推荐如下：

步骤(2)肌糖原(Gn)在GP作用下合成葡萄糖-1-磷酸(G-1-P)：