[发明专利]一种酶促合成紫云英苷的方法

权利要求书

1.一种酶促合成紫云英苷的方法，其特征在于，所述方法以柚皮素NRN 和肌糖原Gn为原料，在体外通过酶促反应分别经二氢山奈酚DHK和葡萄糖-1- 磷酸G-1-P制得山奈酚KMF和尿苷二磷酸葡萄糖UDPG，山奈酚和尿苷二磷酸 葡萄糖再通过酶促反应最终制得紫云英苷。

2.如权利要求1所述的一种酶促合成紫云英苷的方法，其特征在于，所述 方法的具体步骤如下：

(1)克隆、表达和纯化紫云英苷在合成途经中所需的关键酶，所述关键酶包括 糖原磷酸化酶GP、葡萄糖焦磷酸化酶GalU、黄烷酮-3-羟化酶F3H、黄烷酮合 酶FLS1和类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶UGT78K2；

(2)肌糖原Gn在糖原磷酸化酶GP作用下合成葡萄糖-1-磷酸G-1-P；

(3)葡萄糖-1-磷酸G-1-P在葡萄糖焦磷酸化酶GalU作用下合成尿苷二磷酸葡 萄糖UDPG；

(4)柚皮素NRN在黄烷酮-3-羟化酶F3H作用下合成二氢山奈酚DHK；

(5)二氢山奈酚DHK在黄烷酮合酶FLS1作用下合成山奈酚KMF；

(6)山奈酚KMF和尿苷二磷酸葡萄糖UDPG在类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶 UGT78K2作用下最终合成紫云英苷。

3.如权利要求2所述的一种酶促合成紫云英苷的方法，其特征在于，所述 步骤(1)中，分别从拟南芥中克隆黄烷酮-3-羟化酶F3H的基因f3h和黄烷酮合 酶FLS1的基因fls1、从新西兰兔中克隆糖原磷酸化酶GP的基因gp至原核表达 载体pET-32a，构建重组质粒pET-32a-f3h、pET-32a-fls1和pET-32a-gp；克隆黑 豆UDP-葡糖糖的类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶UGT78K2的基因ugt78k2和大肠 杆菌UDP葡萄糖焦磷酸化酶GalU的基因galU至原核表达载体pGEX-5X-1，构 建重组质粒pGEX-5X-1-ugt78k2和pGEX-5X-1-gaIU，分别诱导表达以及纯化融 合蛋白，制备完成所述关键酶。

4.如权利要求2所述的一种酶促合成紫云英苷的方法，其特征在于，在 100μL反应体系中，所述糖原磷酸化酶GP的含量为3.0-4.0ug，所述葡萄糖焦磷 酸化酶GalU、黄烷酮-3-羟化酶F3H、黄烷酮合酶FLS1和类黄酮3-O-葡萄糖基 转移酶UGT78K2的含量均为0.5-2.0ug。

5.如权利要求2所述的一种酶促合成紫云英苷的方法，其特征在于，所述 步骤(2)的pH值范围是6-9，温度范围是10-50℃；步骤(3)的pH值范围是 6-10，温度范围是30-50℃；步骤(4)的pH值范围是2-9，温度范围是10-50℃； 步骤(5)的pH值范围是3-10，温度范围是20-50℃；步骤(6)的pH值范围 是5-10，温度范围是10-50℃。

6.如权利要求5所述的一种酶促合成紫云英苷的方法，其特征在于，所述 步骤(2)中的pH值为6.8，温度为30℃；所述步骤(3)中pH值为7.2，温度 为37.8℃；所述步骤(4)中的pH值为7.5，温度为30℃；所述步骤(5)中的 pH值为7.5，温度为30℃；所述步骤(6)中的pH值为8.0，温度为30℃。