[发明专利]一种噬菌体灭菌时化学抗菌剂筛选方法

说明书

本发明属于医疗卫生保健技术领域，具体涉及一种噬菌体灭菌时化学抗菌剂筛选方法。该方法具体包括制备双层固体培养基、接种病菌和噬菌体、加入抗菌剂、观察判定等步骤。本申请以部分特定菌株和噬菌体及部分广谱性的抗菌剂为代表，对于噬菌体与化学抗菌剂联用时的相互作用、相互影响进行了初步探讨，所提供的噬菌体灭菌时的化学抗菌剂的筛选方法，为筛选获得噬菌体与抗菌剂的最佳组合，以期获得最佳抗菌效果提供了较好的技术保障。总体而言，本发明所提供的化学抗菌剂的筛选方法，操作简单、结果稳定、可信度高，且容易观察和判断，因而在卫生保健领域具有较好地应用前景。

技术领域

本发明属于医疗卫生保健技术领域，具体涉及一种噬菌体灭菌时化学抗菌剂筛选方法。

背景技术

化学抗菌剂通常包括用于体外的消毒剂（如环境消毒和生物体表皮肤黏膜消毒）和用于生物体内治疗感染的天然抗生素或人工合成的抗菌药物。在医疗卫生保健技术领域，为快速、有效控病菌感染，常需大量使用各种类型的化学抗菌剂进行灭菌处理。然而，随着大量广谱类抗菌剂的长期使用，细菌耐药问题逐年加剧，一系列耐药病原菌，如结核杆菌、金萄菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、肠球菌和铜绿假单胞菌等病原菌耐药菌株的出现，引起公众的广泛关注，这也是人们意识到，寻找新的、更为环保和生态的抑制病原菌的用药方式是解决细菌耐药问题根本出路。

噬菌体是一种可以感染并裂解杀灭细菌的天然存在的病毒，最早由Twort和Herelle D两人分别于1915年和1917年发现。由于其对人和动物无害，因此可将杀菌能力强的噬菌体用于自然环境和生物体内环境中的杀菌，以达到防治细菌感染体目的。由于噬菌体灭菌方式的环保性、高效性、特异性，因而使得人们近年对于噬菌体灭菌技术重新产生了浓厚的兴趣。

在化学抗菌剂仍是控制细菌感染主流方法的背景下，采用噬菌体灭菌作为化学抗菌剂的补充具有十分重要的意义。但实际应用过程中，由于噬菌体种类繁多（自然界中超过10⁸种），化学抗菌剂的种类也很多，加之在应用噬菌体杀菌的环境中常常会有化学抗菌剂的残留，而噬菌体与化学抗菌剂杀菌机制又完全不同，因而在噬菌体与化学抗菌剂联合使用时，如何在种类繁多的噬菌体和化学抗菌剂中选择出最佳的组合，是首先需要解决的关键问题。

发明内容

本发明目的是提供一种噬菌体灭菌时，筛选可以联合使用的化学抗菌剂的方法，从而为噬菌体与化学抗菌剂的联合应用提供可靠保障。

本发明所采取的详细技术方案如下所述。

一种噬菌体灭菌时化学抗菌剂筛选方法，具体包括如下步骤：

（1）制备培养基，本发明中采用双层固体培养基，具体为：

首先制备底层固体培养基，即加入1.5%的琼脂粉的LB培养基，灭菌后，无菌环境下倾倒于无菌的9cm平皿中（10mL/平皿），制成固体培养基，凝固后置4℃保存待用，使用前置37℃下预热；

其次制备顶层用半固体培养基，即加入0.5%的琼脂粉的LB培养基，将培养基融化后分装于玻璃试管中（3mL/管），加盖灭菌后，趁热置于45℃水浴中保温以避免凝固；

（2）接种病菌和噬菌体，具体为，将100µL菌液（10⁹ CFU/ml）和100µL噬菌体悬液分别加入到步骤（1）中的半固体培养基中，混合均匀后，倾倒于步骤（1）中的固体培养基中，并铺匀，室温（20~25℃）凝固；

需要解释的是，噬菌体悬液浓度以前期的预实验结果为准，对于噬菌体悬液浓度进行控制主要是控制噬菌体在每个平皿中形成噬菌斑的数量，由于不同噬菌体所形成的噬菌斑的大小不同，因此噬菌体数量（噬菌体悬液浓度）并不是固定的，但以不会构成融合的最大噬菌斑数为最佳；

（3）加入抗菌剂，在步骤（2）中凝固后的双层培养基中滴加5µL化学抗菌剂，培养约8~48h（培养时以所接种病菌的最适生长温度为宜），观察噬菌斑并进行判断；