[发明专利]一种大鼠细胞色素P4501A1酶的表达体系及其构建方法和用途

权利要求书

1.一种大鼠细胞色素P4501A1酶的表达体系，其特征在于：包括宿主大肠杆菌，所述大肠杆菌中定向插入有CYP1A1基因或CYP1A1+基因的原核表达载体，所述的CYP1A1基因和CYP1A1+基因均用于编码大鼠细胞色素P4501A1酶。

2.根据权利要求1所述的大鼠细胞色素P4501A1酶的表达体系，其特征在于：所述的大肠杆菌具体为大肠杆菌BL21。

3.权利要求1或2所述的大鼠细胞色素P4501A1酶的表达体系的构建方法，其特征在于包括以下步骤：(1)、CYP1A1基因ORF的扩增：先扩增出目的片段CYP1A1基因，再设计引物加入信号肽OmpA，以已经扩增出的CYP1A1基因片段为模板特异性扩增出带信号肽OmpA的CYP1A1基因片段，标记为CYP1A1+基因；

(2)、表达载体pCW-CYP1A1和pCW-CYP1A1+的构建：

用NdeI和HindⅢ双酶切上步骤中的PCR产物CYP1A1基因和CYP1A1+基因以及空载pCW，分别回收1600bp、1600bp的目的条带和5000bp的载体条带，将回收产物目的条带和载体条带按摩尔比为3:1-10:1的量混合，用T4连接酶以10℃3min→从10℃经历3min升至16℃→16℃3min→18℃1min，30个循环进行连接，然后连接产物热击转化大肠杆菌DH5α，得到重组质粒，分别为重组表达质粒CYP1A1和重组表达质粒CYP1A1+，将重组质粒挑取单克隆，PCR扩增鉴定、用NdeI、PstI分别单酶切和NdeI与HindIII的双酶切鉴定；

(3)、在大肠杆菌细胞中表达：

将含有重组表达质粒CYP1A1和CYP1A1+的大肠杆菌单菌落接种到LB培养基中，37℃培养过夜，然后稀释到新鲜的TB培养基中，培养至其OD600值为0.7，再加入IPTG至终浓度为1mM，在32℃下诱导24小时取出制样，CYP1A1基因和CYP1A1+基因诱导表达P4501A1酶时以添加或不添加ALA作为筛选表达量的对照，筛选出高表达量的蛋白。

4.权利要求1所述的大鼠细胞色素P4501A1酶的表达体系的用途，其特征在于：将该表达体系所表达得到的大鼠细胞色素P4501A1酶修饰于热裂解石墨电极表面，用于对持久性有机污染物苯并芘的安培检测中。