[发明专利]高纯度替考拉宁精粉的纯化方法

说明书

技术领域

本发明具体涉及一种高纯度替考拉宁精粉的纯化方法。

背景技术

替考拉宁(teicoplanin)系替考游动放线菌(Actinoplanes teichomyceticus)发酵产生的一种多组份糖肽类抗生素,主要含5个化学结构相似的化合物(A2-1,A2-2,A2-3,A2-4和A2-5)，如图1所示，5个组份的差异仅在于酰基侧链的不同，其中A2-2为主要组份，占各组份相对含量的35％-55％，此外含少量的侧链降解产物A3-1。

替考拉宁的结构式：

作为与万古霉素类似的新糖肽抗生素，替考拉宁具有与万古霉素相似的抗菌谱及抗菌活性，在临床研究中的不良反应更少。随着对替考拉宁提取过程和药理毒理作用研究的不断深入，此类化合物在市场中的需求会日益增加。文献报道的替考拉宁的分离纯化过程较为复杂，且组分含量不易控制，

中国专利申请CN102964430A公开了一种替考拉宁的纯化方法，该纯化方法包括如下步骤：调节替考拉宁发酵液至碱性后进行过滤；将得到的滤液调节至酸性后通过大孔吸附树脂，依次用水、氨水洗脱，收集氨水洗脱液；过滤，滤液通过硅胶层析分离，收集体积比为10-50％乙醇水溶液的洗脱液；再将洗脱液调节至酸性后通过截流分子量为5000～30000Da的超滤膜进行超滤，得到超滤液；超滤液通过截流分子量为100～1000Da的纳滤膜进行纳滤，浓缩得到替考拉宁。该方法的缺陷在于硅胶柱层析分离中的硅胶是一次性使用，洗脱时间较长，且硅胶吸附性较强，对样品吸附量大会损失样品；硅胶柱很难封闭式操作，在有水的情况下分离效果有限，且对上样量有限制。中国专利CN 102690333B公开了一种高纯度替考拉宁的制备方法，该方法包括将替考拉宁粗品用水或缓冲盐溶液溶解，加样至装有纳米聚合物微球的色谱柱，使用极性溶剂与水的混合液进行梯度解析，得到各组分及杂质比例符合要求的替考拉宁解析液，经活性炭脱色或树脂脱色，纳滤脱盐浓缩，结晶、过滤、干燥等岁骤，得到高纯度、比例可控的替考拉宁精粉。该方法使用纳米聚合物微球进行柱层析，纳米聚合物微球的骨架结构具有更高的机械强度和化学稳定性，但在分离效果上不及反相硅胶。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种高纯度替考拉宁精粉的纯化方法，采用吸附法、凝胶层析法和色谱法分离纯化替考拉宁精粉，简便快速，效果好。

本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：一种高纯度替考拉宁精粉的纯化方法，包括以下步骤：

(1)将替考拉宁发酵液离心除去发酵液中的固体，得到含替考拉宁的滤液；

(2)将所述滤液进行大孔吸附树脂柱层析，先采用纯水以10L/h的流速洗脱，再用体积比10:90，15:85，20:80，25:75，70:30的丙酮-水溶剂系统以12L/h的流速进行梯度洗脱，收集以70％丙酮水溶液为洗脱剂的洗脱液，并浓缩，得到浓缩物；

(3)将所述浓缩物经过凝胶层析柱过滤，先用体积比10:90或15:85的甲醇-水洗脱；再用体积比35:65或40:60的甲醇-0.5％NaHCO₃水溶液进行洗脱；收集以35:65或40:60的甲醇-0.5％NaHCO₃水溶液为洗脱剂的洗脱液，浓缩以获得浓缩液；

(4)往浓缩液中加入丙酮沉淀30min，得替考拉宁粗品；用水溶解替考拉宁粗品，并加样至反相硅胶层析柱进行层析，先用15％乙腈水溶液洗脱2h，再用30％乙腈水溶液洗脱1.5h，最后用46％乙腈水溶液洗脱，分段收集，通过HPLC检测各段洗脱液中替考拉宁各组分的纯度，将满足纯度要求的洗脱液合并；

(5)往洗脱液中加入1.5～2.5％(w/v)的活性炭脱色20min，过滤，冷却沉淀除去杂质，加入6倍于上清液体积的丙酮于上清液中沉淀，低温结晶得晶体，晶体经红外干燥，得到替考拉宁纯品。

进一步地，所述(1)的具体操作方法如下：

将替考拉宁发酵液调pH至11.0，室温保持15min，再回调至PH 7.5，然后4500rpm离心10min，取上清液稀释至2倍体积。

进一步地，所述大孔吸附树脂为HP20树脂、D3520树脂、HZ816树脂或AB-8树脂。

进一步地，所述(3)中的凝胶层析柱是指葡聚糖凝胶层析柱或琼脂糖凝胶层析柱。

进一步地，所述(4)中的反相硅胶层析柱为C8反相硅胶层析柱或C18反相硅胶层析柱。