[发明专利]Mb1961c蛋白的新用途

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种牛分枝杆菌Mb1961c蛋白的新用途。

背景技术

牛结核病主要由牛型分枝杆菌感染牛引起的一种慢性细菌性疾病，也可感染人类和其他一些动物引起相应疾病，被国际动物卫生组织(OIE)列为需通报的动物疫病。牛结核病直接影响牛的生产力及产品的国际贸易，造成巨大经济损失，同时其作为一种重要的人兽共患病，也是公共卫生的重大威胁。虽然大部分发达国家由于采取“检疫-扑杀”的根除策略和强大的经济支撑，牛结核病的流行率已降至很低水平，但至今尚无任何国家获得OIE“无结核”认可。另外，牛结核病在许多发展中国家仍十分流行，近年来随着养牛业突飞猛进的发展，我国一些地区的发病率也呈上升趋势。因此，如何有效预防和检测牛结核具有重要的经济和社会意义。

鉴于分枝杆菌感染初期机体的免疫应答主要以细胞免疫为主，故牛结核病的检疫主要通过细胞免疫应答为基础的检测手段，包括结核菌素皮内变态试验(TST)和牛结核外周血γ-干扰素体外释放试验(简称IFN-γ法)。其中TST是OIE指定也是应用最普遍的牛结核病检测方法，但其敏感性和特异性受限。IFN-γ法主要检测特异性抗原体外刺激全血后产生的IFN-γ水平，已被OIE认可。这两种方法均使用到结核菌素纯化蛋白衍生物(PPD)，PPD由分枝杆菌培养物灭活提纯得到，成分复杂，其特异性易受交叉反应影响，经常造成诊断结果的假阳性，给生产带来一些不必要的损失。因此，探索特异、敏感的检测抗原对控制牛结核有重要意义。

Mb1961c蛋白是牛分枝杆菌一种主要分泌蛋白，是由毒力相关基因Mb1961c编码的低分子量蛋白质，为牛分枝杆菌静息期分泌的主要膜蛋白。该蛋白分子量为16kDa，其基因共编码159个氨基酸，其中前29个氨基酸为信号肽，130个为成熟蛋白。该蛋白存在于结核分枝杆菌复合群中，且高度保守，在环境分枝杆菌等非致病菌中则不存在该抗原的基因。

目前，尚未有研究将Mb1961c蛋白作为外周血γ-干扰素体外释放试验的刺激剂，用于牛结核病的诊断。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的缺陷，针对牛型PPD存在的非特异性及PPD制备繁琐等不足，提供一种高特异性和高敏感性的PPD替代的重组蛋白牛分枝杆菌Mb1961c蛋白，作为牛结核病外周血γ-干扰素体外释放试验的刺激剂，提高检测结果的灵敏度和特异性。

本发明的第一方面公开了一种外周血γ-干扰素体外释放试验刺激剂，所述刺激剂含有Mb1961c蛋白。

本发明的第二方面公开了Mb1961c蛋白在制备牛结核外周血γ-干扰素体外释放试验的刺激剂中的新用途。

进一步的，所述Mb1961c蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步的，所述Mb1961c蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明的第三方面公开了Mb1961c蛋白的制备方法。所述Mb1961c蛋白可利用常规的基因工程的制备方法获得。例如：通过PCR扩增相应的编码基因序列，经克隆筛选和测序鉴定正确后，利用pET30a质粒构建原核表达载体，将鉴定正确的重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，筛选获得阳性转化子，再以IPTG诱导表达，对以胞内可溶性表达的Mb1961c蛋白进行亲和层析纯化，即得。

进一步的，所述制备方法为：提取牛分枝杆菌基因组DNA作为模板，PCR扩增Mb1961c基因片段，将Mb1961c片段插入pCR2.1载体转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆；酶切、回收和连接Mb1961c与pET30a(+)片段，构建重组质粒pET-Mb1961c，转化大肠杆菌BL21(DE3)；IPTG诱导表达，超声裂解，上清经NI-NTA柱纯化；收集洗脱液于PBS中透析24h，进行浓度和纯度定量，即得。

本发明的有益效果为：