[发明专利]鉴定龟甲的PCR特异引物及其检测方法

说明书

本发明属于中药及中药材鉴定技术领域，特别涉及到一种能够特异鉴定龟甲的PCR特异引物及其检测方法。使用此方法鉴别龟甲的真伪，只通过简单的DNA提取、PCR特异性扩增、荧光检测即可完成对样品真伪的鉴别。具有操作简单、特异性强、重复性好等优点。主要用于龟甲药材、含有龟甲的制剂以及龟甲活体材料的快速鉴定。

技术领域

本发明涉及中药及中药材鉴定技术领域，特别涉及一种能够特异鉴定龟甲的PCR特异引物及其检测方法。主要用于龟甲药材、含有龟甲的制剂以及龟甲活体材料的快速鉴定。

背景技术

中药材龟甲为龟科动物乌龟Chinemysreevesii(Gray)的背甲及腹甲，具有滋阴潜阳，益肾强骨，养血补心，固经止崩之功效。龟科动物种类众多，近年来由于需求量迅猛增长，市场上出现了大量的龟甲混淆品，严重影响了龟甲的用药安全。传统鉴别龟甲的方法包括性状鉴别、显微鉴别、薄层色谱法鉴别、光谱法鉴别、紫外光谱法鉴别等。但是传统的检测方法主要依赖于药材中的化学成分，而化学成分又易受品种及产地的影响。分子标记技术已成功用于中药鉴定，线粒体DNA的Cyt b(中药材龟甲细胞色素b特异性鉴定研究，中国药学杂志，2012，4(3)：182-185)和细胞色素C氧化酶亚基I(Cytochrome c oxidasesubunitI，CoI)，可以作为DNA标记鉴别龟甲(崔丽娜，杜鹤，孙佳明等，基于COI条形码序列的龟甲及其混伪品的DNA分子鉴定[J].吉林中医药，2012，2)。刘中权等利用线粒体12SrRNA基因片段序列建立了龟甲及原动物的高特异性PCR鉴定方法(刘中权，王义权，周开亚等，中药材龟甲及原动物的高特异性PCR鉴定研究，药学学报，1999，12：941-945)，但目前市场上出现了一些新的外来种。李明成等公开了一种龟甲DNA检测试剂盒及鉴定方法(申请号：201310178856.3)，其仅包括5种伪品。

本发明主要结合常规PCR和荧光检测方法，在较短时间内快速鉴定龟甲及其常见伪品，成本低、适用性好。在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中所提及的PCR引物及方法。

发明内容

本发明提供了一种龟甲的PCR特异性引物及其检测方法，该方法操作简单、样品量少、能快速准确的鉴定龟甲药材、粉末制剂以及活体材料，特别适用于鉴定因加工而导致DNA含量极少、形态破碎的中药真伪的鉴定。

一种鉴定龟甲的特异引物F1、F2，其序列为：

F1：5′-TTTGGAAACTGACTTGTACCTTTAACG-3′

F2：5′-GAGTAGTAATAGGACGGCTGTAATAAGTAGA-3′。

一种龟甲的PCR鉴定方法，其特征在于，包括下列步骤：

a)从所述材料中提取得到DNA样品；

b)用权利要求1所述的引物进行PCR反应，PCR反应参数为95℃预变性5min后，进行30次循环，循环参数为95℃30s，55-65℃45s，后延伸72℃5min，获得扩增产物；

c)电泳所述扩增产物，如果存在分子量360bp的单一DNA条带，则确定所检材料为龟甲；

d)直接在所述扩增产物中加入2μL20×SYBR Green I染料，振荡30s充分混匀，于365nm紫外灯下检测PCR产物；如果反应产物发出强烈绿色荧光，则确定所检材料为龟甲。

本发明采用荧光检测方法检测PCR扩增产物，不需电泳使得检测时间大大缩短，且仅需简易紫外灯即可完成操作，不需要使用电泳设备和凝胶成像系统。

综上所述，本发明提供了快速准确鉴定龟甲的PCR特异性引物及检测方法，以龟甲DNA为模板，能将其从与其亲缘关系极近的其他的龟类中，高效、准确地鉴定出来，为龟甲鉴定提供了一种实用的技术。

附图说明