[发明专利]一种鹿蹄草细胞悬浮培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物细胞悬浮培养方法，特别是一种鹿蹄草细胞悬浮培养方法，属生物技术领域。

背景技术

鹿蹄草(Pyrola rotundifolia L)为鹿蹄草科(Pyrolaceae)鹿蹄草属(Pyrola)植物，具有较高的药用价值。有文献报道其具有增强机体免疫力、改善心脑血管系统功能等药效，并应用于肠道感染、肺炎、高血压等疾病的治疗，疗效显著。目前该植物资源基本来源于野生采挖，难以大规模应用，且对采集地生态环境及野生鹿蹄草资源造成极大损害。虽然已有研究人员对鹿蹄草的引种驯化进行了研究与探讨，但依然存在引种驯化率低，栽培条件难于控制等问题。本发明提供一种鹿蹄草细胞悬浮培养的方法，能够在较短时间内获得大量鹿蹄草悬浮细胞，通过生物技术手段解决鹿蹄草资源需求的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鹿蹄草细胞悬浮培养方法，该方法能够在较短时间内获得大量鹿蹄草悬浮细胞，可为提取鹿蹄草有效成分提供充足原料。

本发明采用如下技术方案：

(1)外植体的选择与灭菌：以鹿蹄草叶片作为外植体。采集健康无病害的鹿蹄草叶片，无菌水清洗2遍，在75％乙醇中浸泡1～3min，随后放入0.1％～0.15％的HgCl2溶液中浸泡20～40s，随后用无菌水清洗5遍。所有操作在超净工作台中进行。

(2)愈伤组织诱导：在超净工作台中，将灭菌后的鹿蹄草叶片用无菌手术刀切成边长3～8mm的小叶片，接种到愈伤组织诱导培养基上。愈伤组织诱导培养基配方为：MS+6-BA0.3～0.7mg／L+2,4-D0.3～0.7mg／L+蔗糖20～40g／L+琼脂5～8g／L，PH值为5.6～6.0；培养温度为20～30℃，每天光照0～16h，光照强度1000～30001x。

(3)细胞悬浮培养：在超净工作台中，将生长良好的愈伤组织用无菌研钵碾碎分散，接种到悬浮细胞液体培养基中振荡培养。悬浮细胞液体培养基配方为：MS+6-BA0.5～1.0mg/L+2,4-D0.2～0.5mg／L+蔗糖20～40g／L，PH值为5.6～6.0；接种量为每100mL培养基中加入10～50g愈伤组织，培养温度为20～30℃，每天光照0～16h，光照强度1000～30001x，振荡速度30～100rpm。培养10～15d，得到鹿蹄草悬浮细胞。

(4)培养细胞的扩大繁殖：在无菌条件下，将步骤(3)中所得鹿蹄草悬浮细胞按照体积比1∶10～1∶15的比例接种至增殖培养基中，振荡培养。增殖培养基配方为：MS+6-BA0.2～0.6mg/L+2,4-D0.3～0.5mg／L+蔗糖20～40g／L，PH值为5.6～6.0；培养温度为20～30℃，每天光照0～16h，光照强度1000～30001x，振荡速度30～100rpm，得到大量鹿蹄草悬浮细胞。

采用本发明制备鹿蹄草悬浮细胞，生产周期短、增殖速度快、产量大、能耗少，操作便捷，利于大规模生产操作。

具体实施方式

实施例一：

(1)外植体的选择与灭菌：以鹿蹄草叶片作为外植体。采集健康无病害的鹿蹄草叶片，无菌水清洗2遍，在75％乙醇中浸泡2min，随后放入0.1％的HgCl2溶液中浸泡25s，随后用无菌水清洗5遍。所有操作在超净工作台中进行。

(2)愈伤组织诱导：在超净工作台中，将灭菌后的鹿蹄草叶片用无菌手术刀切成边长5mm的小叶片，接种到愈伤组织诱导培养基上。培养基配方为：MS+6-BA0.4mg／L+2,4-D0.4mg/L+蔗糖30g／L+琼脂6g／L，PH值为5.8；培养温度为25℃，每天光照Oh，即黑暗培养。

(3)细胞悬浮培养：在超净工作台中，将生长良好的愈伤组织用无菌研钵碾碎分散，接种到悬浮细胞液体培养基中振荡培养。培养基配方为：MS+6-BA0.7mg／L+2,4-D0.3mg／L+蔗糖30g／L，PH值为5.8；接种量为每100mL培养基中加入20g愈伤组织，培养温度为25℃，每天光照0h，即黑暗培养，振荡速度80rpm。培养10d，得到鹿蹄草悬浮细胞。

(4)培养细胞的扩大繁殖：在无菌条件下，将步骤(3)中所得鹿蹄草悬浮细胞按照体积比1∶10的比例接种至增殖培养基中，震荡培养。培养基配方为：MS+6-BA0.3mg／L+2,4-D0.4mg／L+蔗糖30g／L，PH值为5.8；培养温度为25℃，每天光照0h，即黑暗培养，振荡速度80rpm。培养15d，3000rpm离心得鹿蹄草细胞，称鲜重，与步骤(2)中所得愈伤组织相比，增重12倍。