[发明专利]一种鹿蹄草细胞悬浮培养方法

权利要求书

1.一种鹿蹄草细胞悬浮培养方法，其特征在于按照如下步骤进行：

(1)外植体的选择与灭菌：以鹿蹄草叶片作为外植体。采集健康无病害的鹿蹄草叶片，无菌水清洗2遍，在75％乙醇中浸泡1～3min，随后放入0.1％～0.15％的HgCl2溶液中浸泡20～40s，随后用无菌水清洗5遍。所有操作在超净工作台中进行。

(2)愈伤组织诱导：在超净工作台中，将灭菌后的鹿蹄草叶片用无菌手术刀切成边长3～8mm的小叶片，接种到愈伤组织诱导培养基上，培养温度为20～30℃，每天光照0～16h，光照强度1000～30001x。

(3)细胞悬浮培养：在超净工作台中，将生长良好的愈伤组织用无菌研钵碾碎分散，接种到悬浮细胞液体培养基中振荡培养，接种量为每100mL培养基中加入10～50g愈伤组织，培养温度为20～30℃，每天光照0～16h，光照强度1000～30001x，振荡速度30～100rpm。培养10～15d。(4)培养细胞的扩大繁殖：在无菌条件下，将步骤(3)中所得鹿蹄草悬浮细胞按照体积比1∶10～1∶15的比例接种至增殖培养基中，振荡培养，培养温度为20～30℃，每天光照0～16h，光照强度1000～30001x，振荡速度30～100rpm。

2.如权力要求1所述的一种鹿蹄草细胞悬浮培养方法，其特征在于步骤(1)中外植体为健康无病害的鹿蹄草叶片，外植体清洗过程为无菌水清洗2遍，在75％乙醇中浸泡1～3min，随后放入0.1％～0.15％的HgCl2溶液中浸泡20～40s，随后用无菌水清洗5遍。

3.如权利要求1所述的一种鹿蹄草细胞悬浮培养方法，其特征在于步骤(2)中愈伤组织培养基配方为：MS+6-BA0.3～0.7mg／L+2,4-D0.3～0.7mg／L+蔗糖20～40g／L+琼脂5～8g／L，PH值为5.6～6.0。

4.如权利要求1所述的一种鹿蹄草细胞悬浮培养方法，其特征在于步骤(3)中悬浮细胞液体培养基配方为：MS+6-BA0.5～1.0mg/L+2,4-D0.2～0.5mg／L+蔗糖20～40g／L，PH值为5.6～6.0。

5.如权利要求1所述的一种鹿蹄草细胞悬浮培养方法，其特征在于步骤(4)中增殖培养基配方为：MS+6-BA0.2～0.6mg／L+2,4-D0.3～0.5mg／L+蔗糖20～40g／L，PH值为5.6～6.0。