[发明专利]一种制备DcR3抗原的方法

说明书

【技术领域】

本发明属于基因工程技术领域，特别涉及一种制备DcR3抗原的方法。

【背景技术】

蛋白质抗原为可溶性抗原，可以通过以下方式制备：（1）天然蛋白质。天然蛋白结构正确，活性稳定，是良好的抗原，但是其来源于组织和细胞，成分复杂，难以分离纯化；（2）重组蛋白质。随着基因工程技术的发展，重组蛋白质已经成为制备抗原的主旋律。目前，重组蛋白表达系统主要有原核表达系统、酵母表达系统、昆虫表达系统、哺乳细胞表达系统等。其中大肠杆菌（E.COLI）原核表达系统是应用最广泛的表达系统，此系统的优点是遗传背景相对清楚，具有使用安全、操作简单、生产量大、生产成本低、周期短等特点。但是大肠杆菌表达的重组蛋白往往形成结构错误、没有活性的包涵体，不能用作免疫原；（3）人工合成多肽。为了制备特异针对某一抗原表位（抗原决定簇）的抗体，可以制备人工表位肽用于免疫。但是多肽分子一般8～20个氨基酸，分子量太小，很难引起机体的免疫反应，所以合成的多肽需要与一个载体蛋白连接以增强其免疫原性，常用的载体蛋白有：BSA（牛血清白蛋白）、OVA（卵清蛋白）、KLH（Knoweyhole Limpet Hemocyanin，钥孔戚血蓝蛋白）、RSA(兔血清白蛋白)、HSA（人血清白蛋白）、GST（谷胱甘肽S转移酶）、MAP（多价抗原肽，主要指多聚Lys）。目前，这种方法的成本较高且制备出的抗体亲和力较低。

恶性肿瘤是严重威胁人类生命健康的一大类疾病，大多数患者的恶性肿瘤被发现时已经到晚期，治疗效果非常不理想。早期发现和诊断，是提高恶性肿瘤治疗效果的手段之一。死亡诱骗受体3(Decoy death Receptor3，简称DcR3)，也称TR6，是近年来发现的肿瘤坏死因子超家族(TNF superfamily)成员之一。近年来研究证明，DcR3在肺癌、肝癌、食道癌、结肠癌、直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、胃癌、神经胶质瘤等多种恶性肿瘤中呈现高表达，是一种罕见的，独特的广谱肿瘤的标志分子。以DcR3作为免疫原制备抗DcR3单克隆抗体可以检测DcR3的表达水平，为癌症的早期发现、诊断及治疗提供关键数据。

由于DcR3基因存在较多的大肠杆菌稀有密码子及其表达蛋白含有较多的二硫键，DcR3在大肠杆菌表达系统中表达量较低，而且形成没有活性的包涵体，不能用作免疫原制备抗DcR3的单克隆抗体。目前，用原核细胞制备人DcR3抗原存在两大问题，一是DcR3蛋白产量较低，杂蛋白多，难以分离纯化；二是其表达的DcR3为没有活性的包涵体，不是人DcR3的正确结构，不能用作免疫原制备单克隆抗体。

【发明内容】

本发明的目的在于提供一种制备DcR3抗原的方法。

本发明的目的通过以下技术方案实现：一种制备DcR3抗原的方法，包括如下步骤：

（1）PCR扩增DcR3基因：根据DcR3基因的序列设计引物，以人DcR3基因全长ORF克隆为模板，扩增DcR3基因；

（2）将DcR3基因插入pET-32a（+）表达载体：用Hind3和NCO1分别双酶切DcR3基因和pET-32a（+）后用T4DNA连接酶进行连接，然后转化到大肠杆菌BL21中，转化菌命名为dBL；提取转化菌的重组质粒，进行双酶切以及测序验证；

（3）DcR3基因的可溶性表达：将dBL单克隆接种于LB培养基中过夜培养，得到菌液；取菌液加到LB培养基中培养至OD₆₀₀=0.6时，加入IPTG至浓度为0.2mM，培养后离心，取沉淀，用PBS重悬；破碎后离心，取上清液进行蛋白电泳，得到可溶性DcR3；

（4）DcR3的纯化：按DcR3基因的可溶性表达条件培养dBL，破碎后将上清液与镍树脂混合，用咪唑洗脱液进行洗脱，取咪唑洗脱液进行蛋白电泳，得到DcR3蛋白。

步骤（1）中所述引物为：

上游引物为CATGCCATGGTGGCAGAAACACCCACCTACC，下游引物为CCCAAGCTTGTGCACAGGGAGGAAGCGCTC。

步骤（3）中：

所述LB培养基为含50ug/ml氨苄青霉素（Ampicillin）的LB培养基；

所述培养的条件为16℃、160rpm；

所述菌液与LB培养基的用量为250ul：5ml；

所述培养后离心为在16℃、160rpm中培养20小时后离心；

所述离心的条件为于8000rpm离心5min；