[发明专利]一种制备DcR3抗原的方法

权利要求书

1.一种制备DcR3抗原的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）PCR扩增DcR3基因：根据DcR3基因的序列设计引物，以人DcR3基因全长ORF克隆为模板，扩增DcR3基因；

（2）将DcR3基因插入pET-32a（+）表达载体：用Hind3和NCO1分别双酶切DcR3基因和pET-32a（+）后用T4DNA连接酶进行连接，然后转化到大肠杆菌BL21中，转化菌命名为dBL；提取转化菌的重组质粒，进行双酶切以及测序验证；

（3）DcR3基因的可溶性表达：将dBL单克隆接种于LB培养基中过夜培养，得到菌液；取菌液加到LB培养基中培养至OD₆₀₀=0.6时，加入IPTG至浓度为0.1-0.3mM，培养后离心，取沉淀，用PBS重悬；破碎后离心，取上清液进行蛋白电泳，得到可溶性DcR3；

（4）DcR3的纯化：按DcR3基因的可溶性表达条件培养dBL，破碎后将上清液与镍树脂混合，用咪唑洗脱液进行洗脱，取咪唑洗脱液进行蛋白电泳，得到DcR3蛋白。

2.根据权利要求1所述的制备DcR3抗原的方法，其特征在于，步骤（1）中所述引物为：上游引物为CATGCCATGGTGGCAGAAACACCCACCTACC，下游引物为CCCAAGCTTGTGCACAGGGAGGAAGCGCTC。

3.根据权利要求1所述的制备DcR3抗原的方法，其特征在于，步骤（3）中所述LB培养基为含50ug/ml氨苄青霉素的LB培养基。

4.根据权利要求1所述的制备DcR3抗原的方法，其特征在于，步骤（3）中所述培养的条件为16℃、160rpm。

5.根据权利要求1所述的制备DcR3抗原的方法，其特征在于，步骤（3）中所述菌液与LB培养基的用量为250ul：5ml。

6.根据权利要求1所述的制备DcR3抗原的方法，其特征在于，步骤（3）中所述培养后离心为在16℃、160rpm中培养20小时后离心。

7.根据权利要求1所述的制备DcR3抗原的方法，其特征在于，步骤（3）中所述离心的条件为于8000rpm离心5min。

8.根据权利要求1所述的制备DcR3抗原的方法，其特征在于，步骤（4）中所述咪唑洗脱液为50mM、150mM、200mM和500mM的咪唑洗脱液。