[发明专利]基于细胞热转移技术的高通量药物靶点筛选方法有效
申请号: | 201310637870.5 | 申请日: | 2013-12-03 |
公开(公告)号: | CN103645324B | 公开(公告)日: | 2017-02-15 |
发明(设计)人: | 胡朝阳;房波 | 申请(专利权)人: | 胡朝阳;房波 |
主分类号: | G01N33/68 | 分类号: | G01N33/68;C12N15/85;C12N15/66 |
代理公司: | 暂无信息 | 代理人: | 暂无信息 |
地址: | 200433 *** | 国省代码: | 上海;31 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 基于 细胞 转移 技术 通量 药物 筛选 方法 | ||
1.一种基于细胞热转移技术的高通量药物靶点筛选方法,其特征在于:包括以下四步:人类全基因组带标签的表达质粒的构建、带标签蛋白的表达和细胞裂解液获取、CETSA检测、高通量标签抗体的ELISA扫描和数据统计分析,具体如下:
(1)人类全基因组带标签的表达质粒的构建:将人类全基因组的各基因的编码区序列片段定向连入Flag-pCDNA3等表达质粒载体,并进行带标签质粒鉴定和标签蛋白表达的检测;以HeLa细胞全基因组转录组RNA为模板,PCR法扩增出目的基因,利用ClonExpressTM II One Step Cloning Kit将目的片段连接到flag-pCDNA3等表达载体上;再将构建成功的pCDNA3等表达重组质粒和内参质粒β-gal瞬时共转染入细胞,培养48 h后检测荧光素酶活性;
(2)带标签蛋白的表达和细胞裂解液获取:实验前1天按照100万个293T或其他细胞铺细胞于10厘米细胞培养皿;18小时后将携带目的基因的阳性pCDNA3等表达重组质粒转染入293T细胞,进行重组蛋白的表达,具体过程为:10厘米细胞培养皿中,每10ug目的质粒;细胞37°C培养于10% 胎牛血清 + DMEM细胞培养基中,孵育48小时后,胰酶法收集细胞,同时加入蛋白酶抑制混合物(Protease Inhibitor Mixture Set III),EDTA和2000活力单位的核酸酶;细胞裂解物提取过程为:将得到的细胞按照100万细胞每毫升PBS比例稀释,vertex混匀,放置液氮10分钟,常温溶解10分钟,如此反复冻融3次;4℃,2000g离心20分钟取上清;
(3) CETSA检测:将得到表达标签蛋白的细胞裂解液进行CETSA检测;步骤(2)中获取的细胞裂解液,一部分加入适宜浓度的待测药物,另一部分加入抑制剂,室温孵育10~30分钟后,将细胞悬液等分成50μl,分别在不同温度下加热3-10分钟;然后将细胞提取物再次20000g,4°C离心20分钟,分离得到的上清液,弃去不溶性沉淀;然后取10μl样品进行酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immune sorbent assay,ELISA);ELISA实验最终得到各药物-蛋白孵育作用后的吸光度值;该吸光度值与CETSA最低的药物-蛋白孵育温度直接相关,据此绘制CETSA曲线和ITDRFCETSA(等温量效反应指纹图谱);
(4)高通量标签抗体的ELISA扫描和数据统计分析:在构建的人类全基因组表达质粒库的基础上,对多种药物、多种靶标蛋白的高通量分析;得到的CETSA数据(ELISA得到的吸光度值)用于分析;CETSA数据和相应的ITDRFCETSA数据进行s形(可变斜率)曲线拟合;或者计算药物对蛋白的半数抑制浓度(IC50),通过Lineweaver Burk曲线得到药物对蛋白的抑制常数Ki。
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