[发明专利]一种烯醇脱氢酶、编码基因、载体、工程菌及其应用

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一种烯醇脱氢酶及其编码基因，含有该编码基因的载体、工程菌及其应用。

（二）背景技术

α,β-不饱和化合物如烯醇、烯醛和烯酮等在化学工业的许多领域中具有重要应用，常用于生产精细化学品、药物和香精香料等。目前，α,β-不饱和烯醇通常是利用化学催化剂对烯醛或烯酮进行选择性加氢而制备。化学法还原α,β-不饱和烯醛或烯酮制备烯醇往往选择性较低，并且伴随着副产物饱和醇的生成。作为化学法的替代，生物催化法制备α,β-不饱和烯醇具有高效、经济、选择性高、条件温和等优点，已越来越受研究者所重视。与化学催化剂只能催化还原反应不同，生物催化剂既可以用于α,β-不饱和烯醛或烯酮的选择性加氢，也可以用于α,β-不饱和烯醇的选择性氧化制备烯醛或烯酮。

用于生物法制备α,β-不饱和烯醇的生物催化剂既可以是整细胞，也可以是酶。因为细胞内含有多种酶，整细胞催化往往会遇到副反应的问题，副反应的存在会降低目标反应产物的得率。对于像烯醛还原生成烯醇这种一步反应来说，酶法催化更具优势，既可以彻底避免副反应的问题，也可以克服细胞膜阻碍底物和产物跨膜传递的问题。因而，通过基因工程技术高产烯醇脱氢酶，将为其在生物法制备α,β-不饱和化合物中的应用奠定良好的基础。

烯醇脱氢酶能够催化烯醛或烯酮的还原生成烯醇，也能够催化烯醇的氧化生成烯醛或烯酮。烯醇脱氢酶属于含锌中链醇脱氢酶家族，以NAD（P）H为辅酶，一般来说都具有苄醇脱氢酶的活力。目前，已从微生物中发现多种烯醇脱氢酶，如醋酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus）、贝氏不动杆菌（Acinetobacter baylyi）、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。这些野生菌中烯醇脱氢酶含量极低，利用其作为生物催化剂进行大规模的工业化生产存在一定的难度，因而构建烯醇脱氢酶基因工程菌从而大量生产重组烯醇脱氢酶具有重要意义。

（三）发明内容

本发明目的是提供一种烯醇脱氢酶基因、含有该基因的重组载体、该重组载体转化得到的重组基因工程菌，及其在生物法制备α,β-不饱和醇/醛中的应用。

本发明采用的技术方案是：

一种烯醇脱氢酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

SEQ ID No.1：

MSIIKSYAAK EAGSELELYE YDAGELRPED VEVQVDYCGI

CHSDLSMIDN EWGFSQYPLV AGHEVIGRVA ALGSAAQEKG

VKVGQRVGVG WTARSCGHCD ACISGNQINC LEGAVATILN

RGGFAEKLRA DWQWVIPLPE SIDIESAGPL LCGGITVFKP

LLMHHITATS RVGVIGIGGL GHIAIKLLHA MGCEVTAFSS

NPSKEQEVLA MGADKVVNSR DPDALNALAG QFDLIINTVN

VDLDWQPYFE ALAYGGHFHT VGAVMKPLPV PAFTLIAGDR

SISGSATGTP YELRKLMKFA GRSKVSPTTE LFPMSQINEA

IQHVRDGKAR YRVVLQADF。

由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的多肽的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该多肽的片段或多肽变体与前述氨基酸序列同源性在90%以上、且具有相同的酶活性，均属于本发明保护范围之列。具体的，所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。

本发明所述蛋白的片段、衍生物或类似物是指基本上保持本发明所述的蛋白酶相同的生物学功能或活性的蛋白，可以是下列情形：（Ⅰ）一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基（优选的是保守氨基酸残基）取代，并且取代的氨基酸可以是也可以不是由遗传密码子编码的；（Ⅱ）一个或多个氨基酸残基上的某个基团被其它基团取代；（Ⅲ）成熟蛋白与另一种化合物（比如延长蛋白半衰期的化合物，例如聚乙二醇）融合；（Ⅳ）附加的氨基酸序列融合进成熟的蛋白而形成的蛋白序列（如用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列）。