[发明专利]一种同时检测四种肿瘤标志物的化学发光试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及免疫检测技术领域，特别涉及一种同时检测四种肿瘤标志物的化学发光试剂盒及其制备方法。

背景技术

近年来，越来越多的证据证明了炎症反应在抑郁症疾病发生、发展过程中的作用，很多的炎性因子和相应的可溶性受体、趋化分子、粘附分子、急性期蛋白等会在抑郁症患者的外周血、脑脊液中显著上升，抑郁症的个别症状如疲劳、认知障碍及睡眠障碍等与炎性因子之间的关系也被不断报道。这些抑郁症相关的生物标志物可以用于辅助临床诊断及预后评价，将为抑郁症的客观诊断提供生物学证据。进一步经过我们应用600多份血清样本对文献报道的抑郁症相关因子进行了大样本量筛选验证，初步确定了脑源性神经营养因子、皮质醇、表皮生长因子、髓过氧化物酶、催乳素、抵抗素、可溶性肿瘤坏死因子α受体II型作为抑郁症辅助诊断的生物标志物。

目前市场上有很多检测相关因子的传统的单项ELISA技术，其成熟度高,特异性好,操作简便。但通常的酶联免疫吸附ELISA检测样本时，每个检测孔一般需要100-200μl，样本用量较大,另外抑郁症的生物标志物不止一个，需要多个因子的联合监测来进行诊断，在这样的情况下若仍依赖于单项ELISA检测，则样本用量过大；对每个因子单独检测来辅助抑郁症的诊断显然费时费力，且诊断成本高昂，患者一般难以承受。

放射免疫分析方法RIA技术，它既具有免疫反应的高特异性，又具有放射性测量的高灵敏度，但存在放射线辐射和污染等问题，而且对检测人员的健康也构成威胁，并且，操作相对于ELISA复杂，一次检验只能测一个指标，还需要提供专门的放射性实验场所，投资高，危害大。

蛋白芯片虽然能实现多个因子同时检测的功能，但由于它是把抗体包被在用于制备蛋白质芯片的基底玻片、微球或膜上，并且基底玻片和膜在使用前要经过醛基化或多聚赖氨酸等预处理，导致生产成本增加，并且后续实验操作繁琐,，重复性差，难于推广。

因此，免疫检测技术领域急需一种工艺简单，便于操作的，灵敏度高，能同时检测四种肿瘤标志物的化学发光试剂盒及其制备方法。

发明内容

本发明提供了一种同时检测四种肿瘤标志物的化学发光试剂盒及其制备方法，技术方案如下：

一种同时检测四种肿瘤标志物的化学发光试剂盒，其特征在于，包括：

经过镀膜处理的SA-HRP试剂盒，并且该SA-HRP试剂盒内含有用脑源性神经营养因子BDNF、表皮生长因子EGF、髓过氧化物酶MPO、和催乳素Prolactin四种抗原标被的以圆形阵列排布的酶标板、聚氧乙烯山梨醇单月桂酸单脂Tween20和牛血清白蛋白BSA抗体、稀释液、一份阳性血清对照样本、一份阴性血清对照样本、洗涤剂、处理酶、发光液。

一种同时检测四种肿瘤标志物的化学发光试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

第一步，制备抗体包被；

将0.1-20ng的脑源性神经营养因子BDNF、表皮生长因子EGF、髓过氧化物酶MPO、和催乳素Prolactin分别加入0.01-0.1mol/l的磷酸盐缓冲溶液中；

进一步地，用全自动点样仪提取10-100nl的上述含有四种特异性因子的磷酸盐缓冲溶液，点样于用等离子处理过的ELISA板的孔中；

进一步地，将点样好的ELISA板置于2-8℃的温度下包被16-24小时；

第二步，对第一步中ELISA板分别进行浇注、封闭、洗涤、晾干后，再保存起来待用；

首先，向PH值为7.4±0.2的磷酸盐缓冲液中，依次加入0-0.05%的聚氧乙烯山梨醇单月桂酸单脂Tween20和3%的牛血清白蛋白BSA，搅拌均匀后，向第一步中的ELISA板中浇注；向PH值为7.4±0.2的磷酸盐缓冲液中，依次加入0-0.05%的聚氧乙烯山梨醇单月桂酸单脂Tween20和5-10%的脱脂奶粉，搅拌均匀后，向第一步中的ELISA板中浇注；

进一步地，将该浇注好的ELISA板放在2-8℃的温度下封闭放置16-24小时或者放在37℃下封闭放置2±0.5小时，或者室温封闭3±0.5小时；

进一步地，用含有非离子型表面活性剂Tween20的PBS溶液对封闭好的ELISA板进行洗涤、晾干后，置于2-8℃的温度下保存待用；

第三步，上样，并将ELISA板放入孵育振荡器中孵育抗体；

首先，取多份病人的血清样本、1份经筛查过的正常人的阴性对照样本和1份阳性对照样本；