[发明专利]一种同时检测四种肿瘤标志物的化学发光试剂盒及其制备方法

权利要求书

1.一种同时检测四种肿瘤标志物的化学发光试剂盒，其特征在于，包括：

经过镀膜处理的试剂盒，并且该试剂盒内含有用脑源性神经营养因子、表皮生长因子、髓过氧化物酶、和催乳素四种抗原标被的以圆形阵列排布的酶标板、聚氧乙烯山梨醇单月桂酸单脂和牛血清白蛋白抗体、稀释液、一份阳性血清对照样本、一份阴性血清对照样本、洗涤剂、处理酶、发光液。

2.一种同时检测四种肿瘤标志物的化学发光试剂盒及其制备方法，其特征在于，包含以下步骤：

第一步，制备抗体包被；

将0.1-20ng的脑源性神经营养因子、表皮生长因子、髓过氧化物酶、和催乳素分别加入0.01-0.1mol/l的磷酸盐缓冲溶液中；

进一步地，用全自动点样仪提取10-100nl的上述含有四种特异性因子的磷酸盐缓冲溶液，点样于用等离子处理过的ELISA板的孔中；

进一步地，将点样好的ELISA板置于2-8℃的温度下包被16-24小时；

第二步，对第一步中ELISA板分别进行浇注、封闭、洗涤、晾干后，再保存起来待用；

首先，向PH值为7.4±0.2的磷酸盐缓冲液中，依次加入0-0.05%的聚氧乙烯山梨醇单月桂酸单脂和3%的牛血清白蛋白，搅拌均匀后，向第一步中的ELISA板中浇注；向PH值为7.4±0.2的磷酸盐缓冲液中，依次加入0-0.05%的聚氧乙烯山梨醇单月桂酸单脂和5-10%的脱脂奶粉，搅拌均匀后，向第一步中的ELISA板中浇注；

进一步地，将该浇注好的ELISA板放在2-8℃的温度下封闭放置16-24小时或者放在37℃下封闭放置2±0.5小时，或者室温封闭3±0.5小时；

进一步地，用含有非离子型表面活性剂的磷酸盐缓冲溶液对封闭好的ELISA板进行洗涤、晾干后，置于2-8℃的温度下保存待用；

第三步，上样，并将ELISA板放入孵育振荡器中孵育抗体；

首先，取多份病人的血清样本、1份经筛查过的正常人的阴性对照样本和1份阳性对照样本；

进一步地对PH值为7.4±0.2的含有1%牛血清白蛋白、0.05%聚氧乙烯山梨醇单月桂酸单脂的磷酸盐缓冲溶液样本稀释液进行稀释；稀释好的待测样本与配制好的标曲点，再向各个反应孔中加入处理酶；

进一步地，将加好溶液的ELISA板放入孵育振荡器中，在18-25℃的室温条件下反应；

第四步，将稀释液加入试剂盒中；

用含有聚氧乙烯山梨醇单月桂酸单脂的磷酸盐缓冲溶液作为洗液，对第三步中反应后的ELISA板洗涤，再对其进行稀释后，分别向试剂盒中的每个孔中加入稀释后的溶液；

第五步，用CCD成像仪拍摄成像，并结合图像分析软件计算出图像的IDV值，根据IDV值绘制标准曲线，并且计算出样本浓度结果；

首先，将稳定的过氧化溶液与鲁米诺或增强子以1:1混合配制成发光液；

进一步地，向试剂盒的每个孔中加入配制好的发光液，在1-10分钟内用 CCD成像仪拍摄成像；

进一步地，由与CCD成像仪配套的图象分析软件将拍摄的图像处理成IDV值；

进一步地，根据IDV 值绘制标准曲线，并且计算出样本浓度结果；

第六步，运用回归模型（softMax）和Excel表格对样本浓度结果进行计算和统计学分析，经综合分析，对该38份病人血清样本的检测检测结果为100%阳性，即敏感性为100%。

3.根据权利要求1所述的一种同时检测四种肿瘤标志物的化学发光试剂盒，其特征在于，第一步中，用全自动点样仪点样，是将抗体探针点置在ELISA孔板内的圆形圈边上，形成圆形阵列化的捕获表面。

4.根据权利要求1所述的一种同时检测四种肿瘤标志物的化学发光试剂盒，其特征在于，第四步中的试剂盒的四壁是经过镀膜处理的。