[发明专利]一种rDNA ITS2序列标记快速鉴定西施舌群体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及鉴定西施舌种质领域，特别涉及一种rDNA ITS2序列标记快速鉴定西施舌群体的方法。

背景技术

西施舌[Coelomactra antiquata（Spengler，1802）]隶属于软体动物（mollusca）瓣鳃纲（Lamellibranchia），异齿亚纲（Heteridonta），帘蛤目（Veneroida），蛤蜊科（Mactridae），腔蛤蜊属（Coelomactra）贝类，中文俗名有：“海蚌”、“红蛋”、“贵妃蚌”等；贝壳外表略呈三角形，壳薄且脆，壳表近顶部呈粉紫色；在自然海区，1龄壳长为4～6cm，重约20g；2龄壳长可达8cm，重110g左右；3龄壳长可达10cm以上，重超过150g，大者可达250g以上。西施舌不仅个体大、肉质细嫩、味道鲜美，而且含有多种营养成分、贝壳外观色泽好看，是一种食药兼备的海产名贵贝类。

西施舌在我国南北沿海均有分布，以山东、江苏、福建、广东等地资源较为丰富。但近十几年来，西施舌自然资源量不断减少，其生长区域不断缩小已呈现出片段化趋势。由于产量很少，西施舌在这些产地的市场上也很难看到，供不应求，价格连年攀升。针对西施舌的资源状况，福建省已于1985年在长乐海区建立了“福建省长乐海蚌资源增殖省级自然保护区”，对捕捞量进行限制。大量研究表明，由于海区各自独特的地理生态环境，西施舌的南北不同地理群体在种质信息上已经存在明显遗传分化，应作为不同的种质管理单元。由于不同群体西施舌表型相近，因此依靠表型进行群体鉴别相当困难。随着人工养殖的苗种异地移引，这在一定程度上容易造成种质的混淆及不良影响；如何区分不同地区来源种苗与后期亲贝选择等，成为西施舌种质资源保护和良种选育工作重要的课题。

目前未有针对西施舌不同群体的分子标记鉴定方法。ITS2序列是介于5.8S和28S rRNA基因之间的非编码序列，因其在核糖体rDNA整体结构功能上的特殊，既具有一定的保守性，又具有较高的可变性，其序列在不同种类、或同种的不同个体中都可能存在较大差异，因此，利用ITS2序列作为西施舌群体鉴定标记具既简明又可靠的特性。

发明内容

本发明目的是提供一种rDNA ITS2序列标记快速鉴定西施舌群体的方法，该方法结果稳定，可重复性强，鉴别方法简单。

为实现本发明的目的，本发明的技术方案是：

一种利用rDNA ITS2序列标记快速鉴定西施舌群体的方法，该方法包括以下步骤：

（1）采集不同群体的西施舌个体，取西施舌样品的闭壳肌组织，提取基因组总DNA，洗脱定溶于TE溶液或双蒸水中，-20℃保存，备用时于4℃保存；

（2）以ITS2-F:5′-GGGTCGATGAAGAACGCAG-3′和ITS2-R:5′-GCTCTTCCCGCTTCACTCG-3′为引物，进行ITS2序列的PCR扩增；然后PCR扩增产物经1.2%-1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，检测完毕进行切胶并利用PCR产物纯化试剂盒纯化回收，纯化产物进行双向测序列，其中无法直接测序的PCR产物，经克隆并进行菌落PCR检验后再测序；应用软件进行不同序列比对，得出特异性位点，判断样品所属。

所述步骤（1）中的TE溶液浓度为100ng/μl。

所述步骤（2）中的PCR扩增的反应体系为30μL，每个反应体系内含：50ng/μL的模板DNA1μL，20mM Mg²⁺的10×buffer2.5μL，5mM each dNTP1.0μL，5μM的引物各1.0μL，Taq酶聚合酶1U，加ddH₂O至30μL。

所述步骤（2）中的PCR扩增反应具体为：反应前94℃预变性4min，接着为35个循环的反应，条件为94℃40s，52℃30s，72℃60s，最后72℃延伸7min。

所述步骤（2）中以DL500标准DNA Marker为分子量标识进行切胶。

所述步骤（2）中的克隆具体为：将纯化好的PCR产物片段连接入载体中T-easy VECTOR，体系10μL：其中T4连接酶1U，2×快速连接buffer5μl，PCR产物2μL，T载体1μL；16℃反应1h，将全部连接产物加入100μl的JM109感受态细胞进行转化，转化过的含感受态细胞的菌液均匀涂布于添加IPTG和X-gal的氨苄青霉素LB平板上，37℃培养培养过夜；挑选白色单一菌落，接种于450μL的LB培养液中，37℃震荡培养到指数级生长或可见云雾状；取1μL培养液做菌落PCR，检测插入的片段，选2个阳性克隆进行测序。