[发明专利]二聚体蝎型探针荧光定量PCR快速检测志贺菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种二聚体蝎型探针荧光定量PCR快速检测志贺菌的方法。

背景技术

目前，有较多的PCR技术应用于志贺菌检测的报道。因ipaH基因具有高度特异性，拷贝ipaH基因具有高度特异性，比其他毒力因子ipaB、ipaC、ipaD基因有更高的灵敏度，是侵袭力的特异标志，因此该基因多次应用于志贺菌的快速检测。但现有的检测方法复杂，灵敏度等方面存在欠缺。

发明内容

本发明的目的在于提供一种易操作，灵敏度高的二聚体蝎型探针荧光定量PCR快速检测志贺菌的方法。

本发明的技术解决方案是：

一种二聚体蝎型探针荧光定量PCR快速检测志贺菌的方法，其特征是：包括下列步骤：

（一）pMDl8-T-ipaH标准品的制备

（1）引物的设计与合成：根据GenBank公布的福氏志贺菌M32063株ipaH基因序列，采用Primer5.0软件设计PCR引物，

上游引物F1：5'-GCTCTCCACTGCCGTGAAGG-3'

下游引物R1：5'-AGTACAGCATGCCATGGTCC-3'；

（2）cDNA的提取

接种福氏志贺菌单菌落于1.5%琼脂平板上,连续画线，37℃培养12～16h；刮取1～2个接种环菌苔加入100μl三蒸水中,混匀,100℃煮沸10min；12000rpm离心10min，取上清，－20℃保存备用；

（3）用普通PCR体系扩增；

（4）PCR产物回收

根据欲回收的PCR产物的量确定加样孔的大小，灌制1.5％琼脂糖凝胶；将待分离的PCR产物点样电泳；紫外灯照射下切取含有目的片段的琼脂糖凝胶块，转至1.5ml离心管中称重；按凝胶的质量加入1.5倍量体积的Binding Buffer，每2min颠倒混匀一次，在55℃～60℃下温育8min左右，且每隔2min弹试管底部，直至胶溶解完全，放置使其冷却至室温；将此液体转至柱子中，室温静置2min，室温下10000rpm，弃废液，将离心柱放回收集管中；加入300μl Binding Buffer，室温静置1min，室温下10000rpm，弃液；加入700μlSPW Buffer，静置2～3min，室温下10000rpm，弃液；加入700μlSPW Buffer，静置2～3min，室温下10000rpm，弃液；13000rpm开盖离心2min以去除柱子中残余的乙醇；将柱子放入一个新的1.5ml离心管中，向柱中央加入在60℃下预热的30μl双蒸水，室温放置1min，13000rpm离心2min；回收得到的产物经电泳鉴定并定量，－20℃保存备用；

（5）连接：pMD18-T载体1.0μl、DNA连接酶Ⅰ5.0μl、PCR回收产物4.0μl，16℃下连接过夜；

（6）连接产物的转化：取100μl贮存于－70℃的钙化菌（大肠埃希菌DH5α），冰浴化开；加入连接产物5μl，混匀，冰浴20min；42℃热休克90s，转移至冰浴中，继续冰浴2-3min；加入LB液体培养基200μl，在37℃摇床中以200rpm的速度摇45min；加入20mg/mlX-Gal40μl、200mg/ml IPTG4μl，混匀；涂在氨苄青霉素的1.5%琼脂LB平板，待胶表面没有液体流动时，37℃恒温倒置培养12-16h；

（7）重组子筛选：用消毒的小枪头挑取独立、分离的白斑4-6个，分别置于内含5ml液体LB培养基及相应抗生素的15ml离心管中，37℃，250rpm振荡培养过夜；

（8）质粒抽提：

取1.5ml培养物倒入离心管中，室温离心10000rpm，弃上清，倒扣，使液体尽可能流尽；

加入250μl预冷的质粒抽提试剂盒的溶液Ⅰ，剧烈振荡；

加入250μl质粒抽提试剂盒的溶液Ⅱ，颠倒数次混匀；

加入350μl质粒抽提试剂盒的溶液Ⅲ，颠倒数次混匀，出现白色絮状沉淀；

室温离心，12000rpm；

取柱子至2ml收集管中，吸取上清于柱子中，室温离心，12000rpm,弃液；

加入500μl大肠杆菌HB，离心，12000rpm，弃液；

加入750μl Wash Buffer，室温离心，12000rpm，弃液；

加入750μl Wash Buffer，室温离心，12000rpm，弃液；

空甩1次，室温离心，12000rpm；