[发明专利]一种克拉拉细胞蛋白纳米磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及免疫分析医学领域，具体的，本发明提供了一种克拉拉细胞蛋白（CC16）纳米磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

矽肺是因在生产过程中长期吸入大量游离二氧化硅引起的以肺间质胶原沉积为特征的肺组织纤维化为主的疾病，是影响范围最广泛的职业病之一，也是对工人健康危害最为严重的一种职业病。近年来矽肺病的流行呈现出群发性、低龄化及致残率高的特点，这给矽肺的防治工作带来了新的挑战。目前对矽肺的纤维化病变尚无特效药物治疗，因此，对矽肺易感人群的早期筛选、早期诊断，探索矽肺发病的早期效应生物标志物至关重要。

肺特异性的克拉拉细胞蛋白(clara cell protein，CC16)是由克拉拉细胞分泌，有抑制免疫、抗炎、抗纤维化、清除沉积在呼吸道中的有害物质及抑止肺表面活性物质降解等作用，参与肺内一系列生理、病理过程，其血清含量可反映呼吸道损伤及肺血屏障完整性早期改变。

目前，临床领域应用的CC16检测方法主要是酶联免疫测定法。酶联免疫测定法具备操作简单、试剂无污染、高于胶体金的敏感性、结果可用仪器测定等特点得以推广，但敏感性相对较低，板间差异大，测值重复性较差，所用标记酶与底物可定量测定范围窄，及仪器测定范围窄等缺点。

发明内容

本发明要解决的问题是提供克拉拉细胞蛋白的纳米磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法，避免了测值重复性差，酶联免疫法灵敏度低，检测范围窄等缺陷。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：克拉拉细胞蛋白（CC16）纳米磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，包括：克拉拉细胞蛋白校准品；偶联有链霉亲和素的纳米磁微粒悬浮液；生物素标记的克拉拉细胞蛋白抗体；克拉拉细胞蛋白抗体酶结合物，所用的酶为辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶纯度RZ≥3.0，活性≥250U/mL；克拉拉细胞蛋白质控品，质控品包括浓度35pg/mL的低值质控品和2000pg/mL的高值质控品；化学发光液A液和B液，A液为5mmol/L，pH8.6的Tris-HCl缓冲液，且该缓冲液中含有终浓度0.7g/L鲁米诺和终浓度0.165g/L对碘酚；B液为0.675g/L过氧化脲；20倍浓缩洗液；反应管。

进一步，所述的纳米磁微粒是表面包裹带有氨基或羧基活性基团的四氧化三铁，粒径10-50nm。

进一步，所述的反应管的材料是透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或玻璃。

试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

（1）克拉拉细胞蛋白校准品的配制：

将克拉拉细胞蛋白纯品用校准品稀释液稀释成校准品浓储液，所述校准品稀释液是含50%牛血清的缓冲液，将浓储液用校准品稀释液稀释至工作浓度，分别为0，20，50，200，800，4000pg/mL；

（2）克拉拉细胞蛋白质控品的配制：

用校准品稀释液将克拉拉细胞蛋白纯品稀释配制成浓储液，将浓储液用校准品稀释液稀释至35pg/mL和2000pg/mL；

（3）纳米磁微粒-链霉亲和素悬浮液的制备：

A、四氧化三铁纳米磁微粒制备

采用沉淀法制备四氧化三铁纳米磁微粒，具体制备方法如下：1）将FeCl₃·6H₂O和FeCl₂·4H₂O以摩尔比2：1加入到蒸馏水中，剧烈搅拌溶解；2）在氮气氛下加0.5M氨水于上述铁盐溶液中，调pH9-10，反应温度65℃，反应时间45min；3）反应结束后，用蒸馏水洗涤至中性，弃上清，于60℃烘干，即得10-50nm的四氧化三铁纳米磁微粒；

B、纳米磁珠表面羧基的偶联

采用分散聚合法进行偶联，具体制备方法如下：取上述制备的纳米磁微粒超声分散在10%PEG8000溶液中，得磁流体溶液，向磁流体溶液中按体积比1：10加入无水乙醇，搅拌30min后，移入带有搅拌器，冷凝管，氮气入口的三颈瓶中，加入交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺；在氮气的保护下，升温至60±1℃，恒温搅拌30min，之后依次加入磁流体体积3%的过氧化苯甲酰，搅拌速度约为500rpm，磁流体溶液相同体积的苯乙烯，磁流体溶液体积25%的丙烯酸，保持氮气气流,其余条件保持不变,反应8-10h，所得产物静置，用蒸馏水反复洗涤，再用盐酸调节pH=1，浸泡24h，静置；再用蒸馏水反复洗涤，除去未包覆的Fe₃O₄磁粉，把沉淀下来的产品放入真空干燥箱中50℃下干燥24h，得到表面联有羧基的纳米磁微粒；