[发明专利]山羊IGFBP3基因cDNA编码序列克隆的方法

说明书

技术领域

本发明涉及动物基因工程技术领域，更具体地说涉及一种从山羊肌肉组织中克隆IGFBP3（Insulin-like growth factor binding protein 3）基因cDNA编码区序列的方法。

背景技术

胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBPs）作为胰岛素样生长因子系统的一员，其与胰岛素样生长因子（IGFs）之间是一个复杂的生长调节轴：IGFBPs与IGFs和酸敏感亚单元(ALS)结合形成三元复合物来运载IGFs，而且通过IGFBPs不同的亲和力与IGFs结合以调节游离IGFs的生物学活性，IGFBP-3是血液中浓度最高的胰岛素样生长因子结合蛋白，同时也是血清IGFs的主要载体，IGFBP-3主要和IGF-Ⅰ结合，有助于维持IGF-I的生物利用度，保证IGF-I的生物功效。因此IGFBP3基因在动物的生长、发育和代谢过程中起着重要的作用。

RT-PCR克隆：是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式反应以及分子克隆相结合的一种技术。首先利用反转录酶将RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板，扩增我们需要的目的基因片段，然后将此片段与载体连接转化到感受态细胞中进行克隆，获得的质粒PCR产物进行测序。此技术利用PCR 技术能在体外进行有效的基因扩增，而不需要内切酶消化和连接酶处理，能够快速获得其它依靠限制性内切酶消化法难于得到的PCR产物；同时该方法能克服普通PCR产物测序引物近端的十几个碱基无法测序获得的缺点。与RACE(cDNA末端快速扩增) 技术相比较而言，目的基因片段的长度明确，成本较低，工作量小。该技术的关键是PCR引物的设计，在起始密码子的上游设计正向引物，在终止密码子的下游设计反向引物，使得PCR产物能包含完整的基因编码区全序列。

分段PCR克隆法：将目的基因分成几个片段来分别克隆，然后再通过亚克隆测序将其拼接起来，此方法成本较高，耗时多且工作量大，一个基因分成几段就需要做几次克隆，然后再进行序列拼接。

获得目的基因编码区序列一般采用克隆或RACE技术，RACE技术是基于PCR技术基础上由已知的一段cDNA片段，通过向两端延伸扩增从而获得完整的3’端和5’端。但该技术与克隆技术相比，目的基因片段的长度不明确，试验成本高，工作量大，对于提取的RNA质量要求较高，因此应用相对较少。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种山羊IGFBP3基因cDNA编码序列克隆的方法。填补在山羊上该基因研究的空白，为进一步研究其在山羊上的功能奠定基础。

本发明采用以下技术方案：

山羊IGFBP3基因cDNA编码序列克隆的方法，包括以下步骤：

A1、从山羊背最长肌组织中提取总RNA，然后将总RNA反转录成cDNA；

A2：以绵羊该基因的序列为模板在起始密码子上游区域和终止密码子的下游区域设计引物；

A3：以cDNA为模板进行PCR扩增；

A4：扩增产物的胶回收和纯化；

A5：纯化的产物进行克隆与测序，即能得到山羊IGFBP3基因cDNA编码序列。

所述的方法，步骤A1包括以下步骤：取用液氮研磨好的组织粉末约80mg，加入预先盛有1mL Trizol的EP管中，振荡混匀后，室温静置5min；加氯仿0.2mL(必须按总体积的1/5)，旋涡仪振荡混匀15s，室温静置5min；4℃下12000rpm离心15min；转移上层水相450μL于另一个新的1.5mLEP管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀后室温静置10min；4℃下12000rpm离心10min；弃去上层清液后，加入4℃预冷的75%乙醇（用DEPC处理水配制）1mL，静置5min，4℃下7500g离心5min；弃上清，用枪吸取多余的液体，空气干燥约3min；加入30μL DEPC处理水，吹打混匀，充分溶解RNA，然后立即反转录成cDNA。

所述的方法，步骤A2中引物为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。

附图说明

图1是山羊IGFBP3基因的PCR产物电泳图。

图2是山羊IGFBP3基因编码区的核苷酸序列和对应的氨基酸序列。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

具体实施步骤：

1、组织样的采集

选取出生后120d的南江黄羊进行宰杀，取其背最长肌组织样品后迅速置于液氮中保存待用。

2、总RNA的提取和cDNA的合成