[发明专利]山羊IGFBP3基因cDNA编码序列克隆的方法无效
| 申请号： | 201310294920.4 | 申请日： | 2013-07-15 |
| 公开（公告）号： | CN104293766A | 公开（公告）日： | 2015-01-21 |
| 发明（设计）人： | 占思远;张红平;李利;王林杰;仲涛 | 申请（专利权）人： | 四川农业大学 |
| 主分类号： | C12N15/10 | 分类号： | C12N15/10 |
| 代理公司： | 暂无信息 | 代理人： | 暂无信息 |
| 地址： | 625014 四*** | 国省代码： | 四川;51 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 山羊 igfbp3 基因 cdna 编码 序列 克隆 方法 | ||
【权利要求书】：
1.山羊IGFBP3基因cDNA编码序列克隆的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：从山羊肌肉组织样品中提取总RNA，然后将总RNA反转录成cDNA；
步骤二：扩增引物的设计及PCR反应：以绵羊该基因的序列为模板在起始密码子上游区域和终止密码子的下游区域设计引物；设计的引物为：
正向引物：5' AGCTCGCTGCCGCCCAGT 3'
反向引物：5' GCTGATCATGTCCTTGGCAG 3'
用cDNA为模板先进行梯度PCR反应，退火温度范围选择50℃到60℃共8个温度点，优化普通PCR的条件。
2.PCR反应体系为25μL体系：0.25 μL的TaKaRa Taq酶，12.5 μL的 2×GC BufferⅡ，4 μL的dNTP Mixture，正反向引物各0.5 μL，6.25 μL的灭菌ddH2O，模板cDNA 1 μL。
3.反应条件为95℃预变性4 min，35个循环（94℃，45 s；53.4℃，30 s；72℃，90 s），最后72℃ 7 min；
步骤三：扩增产物的回收和纯化；
步骤四：纯化的产物进行克隆与测序，得到882bp的核苷酸序列，如序列表SEQ ID NO：1所示，即为山羊IGFBP3基因的编码区全序列。
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