[发明专利]神经肽Y的cRNA原位杂交探针及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学，尤其涉及一种神经肽Y的cRNA原位杂交探针及其制备方法。 

背景技术

神经肽Y是广泛存在于哺乳动物中枢和外周系统的含量最丰富的神经肽之一。在中枢神经系统中，其功能主要包括：促进食物摄取，促使能量转化为脂肪，抗焦虑，抗癫痫，减轻痛觉，降低血压。通常被作为节食药物的靶点，但其在外周系统，它和糖皮质激素和儿茶酚胺可以共同增强应激反应，在应激引起的心血管疾病中起了重要作用。神经肽Y发挥其功能主要通过与它的受体结合来完成，目前已报道的哺乳动物中NPY受体有五种亚型，其中四种在人体内行使功能，Y1和Y5在刺激饮食方面发挥功能，而Y2和Y4对饱腹感进行控制。在形态学方面对动物体内神经肽Y的mRNA水平检测尚属空白。 

发明内容

本发明的目的，就是为了提供一种神经肽Y的cRNA原位杂交探针及其制备方法。 

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案： 

一种神经肽Y的cRNA原位杂交探针，其序列如SEQ ID No.1所示。 

上述神经肽Y的cRNA原位杂交探针的制备方法，包括以下步骤： 

(1)根据Gene bank提供的神经肽Y的mRNA序列设计神经肽Y特异的引物对，并用此引物对扩增出475bp的神经肽Y的片段，作为神经肽Y特异的探针序列： 

(2)构建表达神经肽Y的cRNA探针的质粒；将探针质粒转入DH5a细菌感受态，细菌培养后测序； 

(3)制备神经肽Y的cRNA原位杂交探针。 

步骤(1)中所述神经肽Y特异的引物对序列如下： 

上游引物5’-tcacagaggcacccagagcag-3’； 

下游引物5’-aatggggcggagtccagcctag-3’。 

步骤(2)的具体做法是： 

(a)将小鼠的cDNA用设计的引物对进行PCR扩增； 

(b)将PCR扩增产物用天根的胶回收试剂盒回收； 

(c)将回收的产物在T4连接酶作用下连入pGEM T-easy载体； 

(d)将连接好的质粒转化DH5a细菌感受态，细菌培养后送测序。 

步骤(3)的具体做法是： 

(a)将步骤(2)得到的克隆测序结果用NCBI BLAST工具比对正确后，判断确认神经肽Y的探针序列插入载体顺序是正向的； 

(b)以该克隆为模板，用T7和SP6引物进行PCR扩增出探针的DNA片段； 

(e)将所得的PCR扩增产物用天根胶回收试剂盒回收； 

(d)用SP6RNA聚合酶对探针进行体外转录，得到神经肽Y的cRNA原位杂交探针。 

本发明的有益效果是：本发明对活体动物的模型进行灌注、取材、切片，通过地高辛标记的cRNA探针与组织中神经肽Y的mRNA进行特异性结合，从而方便、准确的观察到组织中神经肽Y在mRNA水平的变化。本发明使用的神经肽Y的cRNA原位杂交探针对神经肽Y在mRNA水平的显示有明确的特异性，达到了检测目的。 

附图说明

图1为本发明神经肽Y的cRNA原位杂交探针检测的神经肽mRNA在下丘脑弓状核的分布图(10×)； 

图2为本发明神经肽Y的cRNA原位杂交探针检测的神经肽mRNA在大脑皮层的分布图(10×)。 

具体实施方式

一、引物及探针的设计： 

根据Gene bank提供的神经肽Y的mRNA序列，设计其特异的引物对，并且用此对引物对扩增出475bp的神经肽Y的片段作为神经肽Y特异的探针序列；引物对序列如下： 

上游引物：5’-tcacagaggcacccagagcag-3’； 

下游引物：5’-aatggggcggagtccagcctag-3’。 

探针序列如SEQ ID No.1所示。 

二、神经肽Y的cRNA探针的质粒的构建： 

1.将小鼠的cDNA用设计的引物对进行PCR扩增； 

2.将PCR扩增产物用天根的胶回收试剂盒回收； 

3.将回收的产物在T4连接酶作用下连入pGEM T-easy载体； 

4.将连接好的质粒转化DH5α细菌感受态，细菌培养后送invitrogen公司测序。 

三、神经肽Y的cRNA原位杂交探针的制备： 

1.将得到的克隆测序结果用NCBI BLAST工具比对正确后，判断确认神经肽Y探针序列插入载体顺序是正向的；