[发明专利]一种纳米抗体融合蛋白及其制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及人免疫球蛋白可结晶片段（crystalizable fragment，Fc）融合骆驼抗人TNFa纳米抗体的表达制备。用这种方法制备的融合纳米抗体蛋白anti-TNF-VHH-Fc，具有更高的抗原结合能力，可用于人类相关疾病的治疗。

背景技术

TNF超家族成员在各种人类疾病的发病机制中发挥着重要作用。因此，这一超家族代表了一种活跃的药物开发靶点。各种针对TNF家族成员的抗体药物及其受体已被FDA批准，还有一些正在进行临床试验。这些试剂可以有效预防风湿性关节炎、银屑病关节炎、银屑病、溃疡性结肠炎和克罗恩病。TNFa为肿瘤坏死因子，针对TNFa已被批准的治疗方法主要是两种：一种是可溶性受体，结合循环的TNFa以阻止TNFa与细胞表面受体相互作用；一种是TNFa的抗体，如Golimumab是一个完全人源化的TNFa单克隆抗体，可以特异性针对人的TNFa，并且已被批准治疗风湿性关节炎、银屑病关节炎以及强直性脊柱炎。与此类似，Certolizumab pegol，一种聚乙二醇化抗人TNFa抗体Fab片段也已用于疾病治疗。大多数TNFa阻滞剂的主要问题之一是它们会产生很多副作用。例如，英夫利昔单抗(Remicade)、依那西普(Enbrel)和阿达木单抗(Humira)都是免疫抑制剂，会增加严重感染风险（如肺结核）同时也会增加中枢神经系统脱髓鞘疾病的风险。使用英夫利昔单抗发生不良反应的患者已被研究和报道，风险包括严重的有时可以产生致命的血液疾病、严重感染、淋巴瘤和实体肿瘤、严重的肝损伤、乙型肝炎复发、肝脾的T细胞淋巴瘤、药物引起的狼疮等。使用英夫利昔单抗也会导致白细胞减少症、中性粒细胞减少症、血小板减少症和全血细胞减少症。除了安全问题，大部分的TNFa拮抗剂都十分昂贵。例如，每个病人一年的英夫利昔单抗费用可达22000美元。因此，更加安全、可负担的起的、有效的备选方案是迫切需要的。

骆驼重链抗体缺失轻链和CH1恒定区，其重链可变区(VHH)直接通过铰链与Fc结构域连接。虽然缺失轻链，HCAb却可正常识别和结合抗原，与抗原结合的亲和力达到纳摩尔(nmol)级，与scFv单链抗体亲和力相当。纳米抗体具有高结合亲和性，人癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)单域重链抗体对CEA的结合亲和性为0.34-55nmol/L，高于小鼠(2.5nmol/L)或人(7.7nmol/L)抗-CEA单链抗体对CEA的结合亲和性。而且FR2区保守序列中含有几个具有亲水性的氨基酸，使得VHH单域抗体具有水溶性好的特点。试验表明，原核表达的VHH抗体在高达10mg/mL浓度时，仍不发生聚集，具有良好的可溶性。由于VHH单域抗体具有可逆重折叠性质，在高温(80-92℃)和高浓度变性剂作用下仍保持抗原结合活性。对迄今得到的VHH单域抗体的稳定性分析表明这些抗体都相当稳定。筛选出的VHH单域抗体与传统抗体相比，在大肠杆菌中较易表达和纯化，摇瓶培养的表达水平通常为10mg/L；而用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)摇瓶培养可以达到100mg/L以上，10L补料分批发酵可以达到1g/L以上，15m³发酵可以达到1kg以上，表达稳定，适合于大规模生产，生产成本极大降低。

抗体的Fc结构域通常包含每个链的至少两个重链恒定区结构域，其二聚化形成Fc结构域。研究表明，与可溶性受体和抗体Fab片段相比较，TNFa的抗体能够通过膜结合TNFa在人T细胞和巨噬细胞中转导凋亡信号，并且交联Fab片段以增加抗体的稳定性也可以诱导细胞凋亡，暗示了多聚体的相互作用对于抗体诱发凋亡途径从而增强抗体效应具有重要作用。已有研究报道IgG抗体骨架能够诱导补体结合与抗体依赖的细胞毒性，而且Fc融合蛋白具有二价抗体的相似效应即在血液中有较长的半衰期和增强的抗原亲和力。IgG融合蛋白的构建方式大多是将IgG的Fc(Hinge-CH2-CH3)片段或CH(CH1-Hinge-CH2-CH3)片段的N端与活性蛋白的C端相连，以避免构建融合蛋白可能对活性蛋白生物活性造成的影响。此外，IgG的融合蛋白可以通过ProteinA亲和层析得到高效便捷的纯化。因此尽管很多细胞因子与IgG的融合蛋白还处于研究的前期阶段，但是由于其高效性、半衰期长及纯化方便的特点已经引起广泛的关注。