[发明专利]一种纳米抗体融合蛋白及其制备方法及应用

权利要求书

1.一种纳米抗体融合蛋白，其特征在于，所述纳米抗体融合蛋白由骆驼抗人TNFa的VHH抗体片段和人免疫球蛋白G的Fc片段相连构成的融合蛋白，其中，所述骆驼抗人TNFa的VHH抗体片段的核苷酸序列如SEQ ID No：1、SEQ ID No：3、SEQID No：5、SEQ ID No：7、SEQ ID No：9、SEQ ID No：11、SEQ ID No：13、SEQID No：15、SEQ ID No：17或SEQ ID No：19中的任意一种序列所示，所述人免疫球蛋白G的Fc片段的核苷酸序列如SEQ ID No：21所示。

2.根据权利要求1所述的纳米抗体融合蛋白，其特征在于，所述纳米抗体融合蛋白由人免疫球蛋白G的Fc片段通过一个连接肽和骆驼抗人TNFa的VHH抗体片段相连。

3.制备权利要求1任意一项所述的纳米抗体融合蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）骆驼抗人TNFa的VHH抗体片段基因即anti-TNF-VHH基因及人免疫球蛋白G的Fc片段基因即IgG1Fc基因的获得；

（2）利用重叠延伸PCR连接anti-TNF-VHH基因和IgG1Fc基因得到anti-TNF-VHH-Fc融合基因；

（3）将上述anti-TNF-VHH-Fc融合基因进行双酶切得到混合物，直接对混合物进行磷酸化得到anti-TNF-VHH-Fc磷酸化混合液，同时将pPICZaA载体进行双酶切后进行去磷酸化得到pPICZaA去磷酸化混合液，用连接酶将anti-TNF-VHH-Fc融合基因连接到pPICZaA载体上获得重组表达载体pPICZaA-anti-TNF-VHH-Fc；

（4）用上述（3）中得到的重组表达载体pPICZaA-anti-TNF-VHH-Fc线性化，线性化后进行纯化、浓缩、鉴定，最后电转化入酵母细胞得到重组菌株；

（5）培养重组菌株，筛选高抗性重组菌株，并进行重组融合蛋白的表达，然后回收和纯化得到纯化的重组融合蛋白。

（6）将步骤（5）纯化的重组融合蛋白进行质谱鉴定即为纳米抗体融合蛋白。

4.权利要求1或2所述的纳米抗体融合蛋白在制备检测试剂、自身免疫性疾病等免疫调节药物中的应用。