[发明专利]一种可注射丝素蛋白原位凝胶的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种可注射丝素蛋白原位凝胶的制备方法及其应用，具体涉及一种以天然来源的丝素蛋白为基础制备可注射丝素蛋白原位凝胶的方法及其在组织缺损修复、皮肤病防治及皮肤美容、手术后止血防粘连及药物缓释等医疗领域的应用，属于生物材料和生物医学领域。

背景技术

用天然和合成的聚合物制成的凝胶是研究组织工程和药物递送的重要载体。在临床应用中，希望可以通过针头或导管将流动性的液体或半固体凝胶注射到体内，再通过控制某种物理或化学条件诱导其快速形成水不溶性的固体状凝胶，即可注射原位凝胶,从而实现无痛、免开刀治疗。对于大多数组织修复和药物缓释应用来说，治疗的周期都较长（几周至几个月），通常使用的医用聚合物凝胶，如胶原蛋白、透明质酸、聚乙酸等由于降解时间通常较快（几天至几周），很难达到临床应用的要求。而近些年国内外正在开发的新型医用生物材料-丝素蛋白生物材料则以其生物相容性好、降解缓慢等优点越来越引起人们的关注，具有广阔的临床应用前景。

丝素蛋白是从蚕丝中提取的天然生物材料，可以加工成薄膜、颗粒、多孔支架和水凝胶等多种材料形态。低浓度的丝素蛋白凝胶（重量百分比1－6％）为果冻态，可以通过针头直接注射，其体内降解时间为1-4周。浓度高于8％的丝素蛋白凝胶机械强度较高，呈现蜡质，一旦完全成胶，则很难以注射的方式进入到体内。高浓度的丝素蛋白凝胶在体内的降解时间为几周到几个月，因而对大多数的组织修复（如肌肉、皮肤、脂肪）及药物缓释更有应用价值。迄今在动物体外和体内进行的高浓度丝素蛋白凝胶实验通常是将丝素蛋白溶液预先诱导形成凝胶，再将固体状的凝胶通过手术移植到体内，这给临床实践带来了很大的不便，阻碍了丝素蛋白凝胶的进一步应用。

开发可注射原位丝素蛋白凝胶技术的前提是能够在室温下长时间保存高浓度的丝素蛋白溶液，这样在使用时可以快速方便地诱导其成胶。从蚕丝中提纯的丝素蛋白溶液浓度通常为3～10%，4°C低温下可以保存1-3个月，之后会逐渐变性形成凝胶。通过聚乙二醇透析法或超滤法等浓缩的10～30%的浓溶液在4℃低温下仅可以保存1～2周。无论低浓度还是高浓度的丝素蛋白溶液在冷冻干燥后都很难再完全溶于水，回复到起始的溶液状态。因此，迄今所有的丝素蛋白凝胶和其他的材料形式（薄膜、颗粒、多孔支架等）都是利用新鲜的丝素蛋白溶液或浓缩液进行制备。

现在实验室和生产中常用的制备丝素蛋白凝胶的方法有以下几种：

化学方法：

（1）改变溶液酸碱度（pH值）

丝素蛋白的等电点(pI)在4左右，因而调节丝素蛋白溶液的pH值至4左右可以中和丝素蛋白分子携带的电荷，促进分子间疏水基团的相互作用，进而诱导分子结构的改变及分子间的物理交联，最终形成网络状的凝胶结构。这个过程通常较慢，在室温或37℃下达到稳定状态的凝胶至少需要一天的时间，且很难精确控制成胶时间。此外，丝素蛋白凝胶内较低的pH值环境会影响凝胶中包埋的药物分子的稳定性和生物活性，并会引起凝胶周围组织的炎症反应。因此，这种制胶方法通常只用于实验室的基础理论研究，很难临床应用。

（2）盐析

盐析法是指向蛋白质溶液中加入一定量的无机盐（如氯化钠、硫酸铵），造成蛋白质溶解度的降低，进而从溶液中沉淀析出，是蛋白质化学中常用的纯化方法。由于丝素蛋白结构的特性，如果向丝素蛋白溶液中添加氯化钠和硫酸铵等无机盐，丝素蛋白会快速变性凝聚，形成不稳定的黏稠态的液体，再经过一段时间的孵育形成稳定的半固态凝胶。整个成胶的速度决定于盐浓度，通常需要加入大量的盐颗粒或饱和盐溶液才能在较短的时间内诱导丝素蛋白形成凝胶。但在向丝蛋白溶液中加入盐颗粒或饱和盐溶液的一瞬间，由于局部盐浓度过高，会使得周围的丝蛋白快速凝集，形成不均匀的凝胶团块。因此，这种方法很难对凝胶形成的时间和形态进行精确的控制。此外，凝胶中极高的盐浓度（至少1M以上）会在体内引起严重的炎症反应和其他不良反应，因而很难用于临床实践。

物理方法：

（1）超声震荡法

将超声细胞破碎器的探头置于丝素蛋白溶液中，经几秒种的短时间超声波处理，丝素蛋白在溶液中开始变性形成凝胶。成胶的时间可以通过控制超声强度和超声时间来控制。理想状况下固体状的凝胶应在超声结束之后5－10分钟之后形成，这样可以在成胶之前有充裕的时间向丝蛋白溶液中混入药物分子和细胞。这种制备丝素蛋白凝胶的方法快速简便、安全无毒，现已广泛用于组织工程学和药物缓释等方面的研究。虽然从原理上这种方法可以应用于临床治疗，实现可注射原位凝胶的制备，但由于需要使用较特殊的设备并需要一定的操作技巧，因而很难在实际应用中进行推广。