[发明专利]一种水稻直链淀粉含量控制基因Wx的基因型鉴定引物及鉴定方法

说明书

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，具体涉及一种水稻直链淀粉含量控制基因Wx的基因型鉴定引物，还涉及一种水稻直链淀粉含量基因Wx的基因型鉴定方法，该方法具有简单、准确、成本低并可以在水稻生长早期进行非破坏性检测等优点，适于在育种中对Wx基因型的大量筛选从而选育具有不同直链淀粉含量品种。

技术背景

世界上超过一半的人口以水稻为主食，提高水稻品质一直是育种学家的主要目标。稻米的主要成分是淀粉（约占精米的90%），包括直链淀粉和支链淀粉两种，其中直链淀粉含量（AC）是稻米品质的重要理化指标，AC的高低与米饭的粘性、柔软性、光泽和食味品质密切相关，对米质优劣起主要决定性作用，适中的AC是优质稻米的重要指标，一般将水稻直链淀粉含量分为4个等级：极低（<9%）、低（9～20%）、中（20～25%）和高（>25%），育种实践表明，要获得适中AC的杂交稻,其亲本选配原则是低AC值与中、高AC值配组或中AC值之间配组，因此，选育具有AC差异的不育系和恢复系配组杂交稻是获得适中AC的杂交稻的关键；在工业上不同AC稻米有不同用途，低AC稻米可用于制作婴儿食品，而高AC稻米适于制粉丝、味精、酿啤酒和生物降解材料，因此培育具有不同AC品种满足育种和工业各种需求具有重要的经济效益和社会效益。

多项研究表明，稻米直链淀粉的合成是由水稻Wx基因编码的颗粒结合淀粉合成酶(granule-boundstarchsynthase,GBSS)控制的，AC的高低与Wx基因第一内含子的剪接效率密切相关，若第一内含子+1位置（In1）碱基为G，则第一内含子被高效剪接AC增加；若In1碱基突变为T，则剪接效率降低AC降低，因此，通过鉴别Wx In1 SNP碱基类型即可实现对Wx不同基因型的选择，从而选育具有不同AC品种。目前有多种SNP鉴定方法，包括低通量的测序法、限制性内切酶酶切法；中等通量的SNaPshot、质谱法、高分辨溶解曲线分析法以及高通量的SNP芯片技术，但这些方法多技术繁琐、程序复杂、成本较高，不适于育种中对Wx基因的高通量检测。DNA分子标记技术是一种被广泛应用于育种学、遗传学和物种起源与进化等领域的新型生物技术，是DNA水平上遗传多态性的直接反映，具有众多优点：1）具有较高多态性；2）能够明确辨别等位基因；3）选择中性；4）检测手段简单、快速；5）开发成本和使用成本低廉。根据Wx In1位点序列蔡秀玲等（植物生理与分子生物学学报,2002,28(2):137-144）开发了PCR-AccⅠ分子标记，该标记为共显性标记，但缺点是PCR片段需要酶切，程序繁琐，成本高；毛兴学等（中国水稻科学,2005,19(3):285-287）开发了PCR一步法检测标记，该方法只需简单PCR电泳就可完成，但为显性标记，只能通过电泳条带的有无判断目标位点SNP类型，无法将纯合型单株与杂合型单株区分开，因此也限制了它在育种中的应用。

两对交叉引物PCR（PCR with confronting two-pair primers,PCR-CTPP）是一种操作简便、分型快速、费用低廉的SNP分型方法，该方法通过一次PCR反应和常规电泳技术即可区分3种不同基因型，其基本原理为：引物3′末端错配时延伸效率降低，扩增受阻；在SNP位点上下游设计2条外引物，以SNP突变位点为3′终末端在其两侧设计2条特异性内引物，根据4条引物组合扩增片段的大小和数量鉴定SNP类型，因此，该方法适于一般育种单位的中小型试验室对较大群体的批量检测。

本发明在PCR-CTPP方法的基础上加以改进（图1），通过在内引物倒数第三位引入错配碱基，开发出一套利用PCR电泳便可区分Wx基因In1位点3种不同基因型的功能标记，通过设计4条引物及待测品种基因组DNA进行PCR扩增，根据扩增条带类型判断Wx基因型，In1位点为纯合G型的材料扩增出207bp与387bp条带；纯合T型材料扩增出235bp与387bp条带；GT杂合型材料扩增出207bp、235bp与387bp条带，并且387bp的共有条带可作为Wx基因存在的参照（图2、3），因此利用一次PCR扩增就可将3种不同基因类型材料完美区分，该方法简单可靠、成本低廉，适于田间的大群体筛选检测，提高育种效率。

发明内容