[发明专利]野生茄子细胞色素氧化酶基因StCYP77A2及其表达载体和应用

说明书

技术领域

本发明涉及野生茄子细胞色素氧化酶基因StCYP77A2及其表达载体和应用，属于植物基因工程领域。

背景技术

细胞色素P450(Cytochrome P450，以下简称CYP450)是一类血红素氧化酶系，从简单的细菌到高等动植物普遍存在，形成的酶在生物细胞通过可逆性的变化而进行电子传递，参与生物界多种重要的代谢过程。研究表明，其三维结构非常保守，经典的CYP450在催化中心有高度保守的FXXGXRXCXC的结构域。P450应用于植物抗病工程有着巨大潜力,如:1)抑制基因活性:从烟草毛状腺分离的具有羟化酶活性P450(CYP71D16),在运用反义和共抑制技术鉴定其功能时,发现CYP71D16催化的底物(cembratrieneol)明显增加,使得植株避免了蚜虫的侵染。最近,已获得CYP71D16的启动子,可调控植株产生新的分泌物,提高植物的抗病能力。植株经伤口处理后,CYP74的过量表达则能引起茉莉酸过早过量的积累,说明AOS的过量表达可能是控制高等植物抗病动力学的1种途径。2)引进外源代谢途径:非豆科类的拟南芥植株,经转入异黄酮合酶基因后,能在体内积累5,7,45-三羟基异黄酮（催化生氰糖苷合成的3个酶基因(CYP79A1、CYP71E1和UGT85B)转入拟南芥中,获得的转基因植株在生理表型和适应性上没有发生变，但是,植株能合成新的天然产物(生氰糖苷),获得对跳甲(Phyllotreta nemorum)的抗性。

1994年，Toshihiro Toguri和Kazuhisa Tokugawa从茄子下胚轴组织中克隆得到2个序列相同为71%的CYP450家族基因，但这两个基因的cDNA序列与其他任何CYP450家族基因的同源性均低于30%，因此将这两个基因命名为CYP77Al和CYP77A2的，属于一种新的P450家族。目前，对CYP77家族的研究还很有限，也仅限于少数的几个物种中克隆得到部分全长cDNA或中间片段。CYP77A2目前仅在少数几种植物上被克隆，如栽培种茄子和葡萄。

黄萎病（Verticillium Wilt）,是由大丽轮枝菌（Verticillium dahliae Kleb）侵染引起的茄子重要病害之一。该病原菌分布广，寄主多，如陆地棉、茄子、番茄、马铃薯、甘蓝、油菜、白菜、辣椒等，严重影响了这些作物的产量与品质，造成巨大的经济损失。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种野生茄子细胞色素氧化酶基因StCYP77A2。

本发明的另一目的是提供含有该基因的表达载体。

本发明的有益效果提供该基因及其表达载体的应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

StCYP77A2基因，核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

所述的StCYP77A2基因编码的蛋白质StCYP77A2，氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

含有所述的StCYP77A2基因的表达载体。

所述的表达载体优选以PCB2008E为出发载体，将所述的StCYP77A2基因插入PCB2008E的Hind III和BamH I酶切位点间所得。

所述的StCYP77A2基因在构建抗黄萎病转基因烟草中的应用。

所述的StCYP77A2基因的表达载体在构建抗黄萎病转基因烟草中的应用。

有益效果：

本发明以野生茄子托鲁巴姆（Solanum torvum Swartz）为材料,采用同源克隆法扩增StCYP77A2基因。将StCYP77A2基因构建转烟草表达载体，以烟草NC89为供体，进行农杆菌侵染，获得的再生植株经PCR、southern验证，检测出转基因植株。采用灌根法和伤根法进一步对经过验证的转基因植株的黄萎病的抗性进行分析，结果表明，在接种黄萎病菌后，过量表达StCYP77A2的转基因烟草的发病率和病情指数明显低于对照组，可以说明该基因对黄萎病有一定抑制作用。因此，StCYP77A2基因可以作为抗性基因资源被应用于茄子等作物的抗黄萎病育种中。

附图说明

图1植物表达载体PCB2008E-CYP77A2的构建

图2StCYP77A2转基因烟草植株的PCR检测

+:质粒阳性对照；-：未转基因烟草;1～11:转基因烟草

图3转CYP77A2基因烟草的southern分析