[发明专利]无菌斑马鱼的生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种无菌斑马鱼的生产方法。

背景技术

在1870年由巴斯德和科赫提出的细菌疾病理论极大的改变了我们的概念化，以及说明了我们与微生物的各种关系。细菌理论研究的成果在医学和公共卫生方面有着意义深远的进步，以及对微生物有一个广泛的概念化，例如病原体。在宿主与微生物相互作用关系中，那种长期以病原体为中心的观点会让我们忽视这一个事实，即动物所遇到的大多数微生物并没有引起明显的疾病，并且可以被认为是与宿主在共生或者互利共生关系的移住民。这些微生物居民包括细菌，古细菌以及真核微生物，其中有许多不能在体外培养。在基因组时代，对非致病的宿主与微生物之间相互作用的研究让我们受益巨大，并让我们对这些微生物群落的组成和能力的认知显著扩增。这项研究大主体已经建立，即动物微生物非致病成员在动物正常出生后的发育及生理方面发挥了显著的作用，从体内免疫稳态到新陈代谢方面。此外，微生物群还和许多疾病的发病有关，包括过敏，炎症性肠道疾病，癌症以及肥胖。对宿主和其定植微生物之间分子交流的理解的提高使我们有希望找到促进人类和动物健康的新医疗策略。

我们现在所知道的关于微生物群落如何有助于宿主的生物学和病理学都是从研究无菌动物所获得的。无菌这个词是来源于希腊词语“gnosis”(knowledge)和“bios”(life)，并且指一种实验环境即环境里所有的微生物都是确定的或者是没有的。无菌实验的建立是根据在没有任何微生物条件下养殖动物的能力，用特定的微生物菌种在其体内定植或者更复杂的协作。无菌实验的概念可以追溯到巴斯德，他在1885提出的假设即动物在没有微生物的条件下是不可能存活的。这个假设仅在11年后就被推翻了，1896年Nuttal和Thierfelder用无菌剖腹产生产第一个无菌动物——豚鼠，并且养到13天。这一开始报导不久以后就成功生产出无菌小鸡，山羊和一群其他动物，鸟类和两栖动物。尽管这些早期的研究证实动物可以在没有微生物的条件下存活，但是无菌脊椎动物连续的生产至始至终都没有获得成功，直到1940年Reyniers和他的同事在圣母大学以及Gustafsson和他同事在伦德大学才能获得成功。无菌脊椎动物连续的生产的成功主要是由于在无菌动物营养学获得关键的进展。虽然无菌动物的可行性推翻了巴斯德的假设，但是在一方面是对的，即没有微生物情况下会影响动物生物学的许多方面。

尽管大多数的无菌脊椎动物的研究都集中在哺乳动物和鸟类，但是也有人试图在无菌条件下养殖鱼类。Baker和Ferguson是第一次报导成功获得无菌鱼，卵胎生新月鱼，在卵黄吸收后用杀菌饲料喂养可以存活几周时间。在这一发现之后又成功获得了无菌卵生罗非鱼，多卵生鲑鱼种类，多卵胎生花鱂科鱼类和多卵生红鲈。尽管这些开创性的报导证实无菌鱼可以在一定时间内存活，但是他们不包括无菌鱼的基本形态和生理特性，也没有说明无菌鱼的特定营养需求，也没有评估用微生物在无菌鱼定植的结果，也不能获得生长到性成熟的无菌鱼。

在过去的三十年里，斑马鱼已经成为一个重要的基础和生物医学研究的模式动物。斑马鱼卵是在体外受精的，这导致胚胎在孵化成为自由生活幼鱼之前----受精后3天是在它的保护膜内发育的。斑马鱼幼鱼开始进食是在受精后5天，以及幼体鱼到成鱼的变态发育是在受精后14天开始。斑马鱼具有额外的吸引性特征来分析宿主和微生物之间的相互作用，包括丰富的遗传学背景和基因资源，在发育过程中光透明特性允许我们在体内观察宿主和微生物细胞，并且可以控制进一步基因筛选（宿主和微生物都可以）和化学筛选。这些属性，结合斑马鱼和哺乳动物基因组，解剖水平和生理水平之间有广泛的同源性，让斑马鱼作为人类生物学和病理学一个有用的模式动物。

无菌动物模式便于分子一系列的参数，首先，无菌动物可以用于研究微生物如何定植或者微生物代谢产物如何影响宿主生物进程，包括基因表达，发育，生理，免疫和寿命。这可以使无菌动物在特定时间点暴露在个别菌种，特定的微生物或者产物然后分析宿主的反应来完成。宿主的功能和微生物的基因产物可以通过在相应的菌种进行基因操作来检测。第二，无菌动物是一个非常好的平台去研究微生物与微生物之间的相互作用在活体宿主的生理环境内。我们可以用确定的微生物种类或者基因型组合让它们定植在无菌宿主体内，然后就可以用培养或DNA序列检测微生物群落在活体内之间的竞争。这些宿主与微生物以及微生物和微生物之间的相互作用可以作为一个函数用来分析微生物基因型，群落竞争，宿主基因型，宿主发育阶段，宿主生理，宿主体内定植微生物的历史，解剖学定位，饮食和其他环境和生理参数。