[发明专利]猪链球菌种水平荧光定量PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及猪链球菌的分子生物学检测，具体地说，涉及一种猪链球菌种水平荧光定量PCR检测方法。

背景技术

猪链球菌是革兰氏阳性兼性厌氧球菌，作为一种人畜共患病原菌,越来越受到人们的关注。按荚膜抗原分为35型，分别是1型～34型和1/2型。其中2型、1型、9型、7型、14型等是导致人类感染的常见血清型。之前已建立了针对血清2型的荧光定量PCR检测方法，进一步工作中发现需要建立一种针对猪链球菌种水平的荧光定量PCR检测方法，不仅血清2型检测阳性，其它常见血清型也检测阳性。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪链球菌种水平荧光定量PCR检测方法。

为了实现本发明目的，本发明提供猪链球菌种水平荧光定量PCR检测引物对和探针，所述引物对包括：

正向引物128-F：5’-AATGCAGGTAGTTCAAGTCTAAAATGG-3’

反向引物128-R：5’-AACCGCAACCGTATGATTAGGA-3’，

所述探针为128-P：5’-FAM-ATCAAATGCCAGAAGAA-MGB-3’。

本发明还提供含有上述引物对和探针的用于种水平检测猪链球菌的试剂盒。优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液中的一种或多种。更优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。

本发明进一步提供一种猪链球菌种水平荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：1）提取样品中的DNA；2）以步骤1）中提取的DNA为模板，利用所述引物128-F和128-R及探针128-P进行荧光定量PCR扩增反应；3）分析PCR产物。

所述PCR反应体系以20μl计为：

PCR反应条件为：95℃10秒；95℃5秒，60℃45秒，共40个循环。

依据已发表的14株猪链（A7、SS12、JS14、GZ1、P1/7、SC84、98HAH33、05ZYH33、S735、BM407、D12、D9、ST3、ST1）全基因组序列比对，发现作为核心基因组(core genome)的ackA基因是这些已测序猪链球菌菌株所特有的，在其他菌株中同源性很低，而且ackA基因在猪链球菌株个体间变异度小。本发明针对该基因设计了荧光定量PCR检测引物对和探针，并基于Taqman-MGB探针Real-timePCR技术，建立针对猪链球菌种水平的快速检测方法。具体地，针对猪链球菌种特异基因ackA序列，应用Beacon Designer7.0软件，设计出引物和Taqman-MGB探针，建立Real-timePCR检测方法；把目的片段克隆到pMD18-T载体上，绘制标准曲线；以血清1/2、1、2、3、5、7、9、14型猪链球菌以及120株分离株检测引物探针的灵敏性，以常见致病菌及条件致病菌验证引物探针的特异性；制备血液模拟标本评价本方法在临床标本中的应用。结果表明，从标准曲线可以看出，该方法可以检测到100个拷贝/反应体系的目的基因,灵敏性检测显示血清1/2、1、2、3、5、7、9、14型猪链球菌以及120株分离株均有荧光信号,其他常见致病菌及条件致病菌均无荧光信号，血液模拟标本中3.5×10²CFU/ml的细菌含量可被检出。因此，本发明以ackA为目的基因建立的Real-timePCR检测方法针对猪链球菌种水平，涵盖常见致病血清型，特异性好，灵敏度高，可快速、准确地用于疑似标本的初步筛查。

附图说明

图1为本发明实施例2中质粒标准品的Real-timePCR检测荧光信号图。

图2为本发明实施例2中根据质粒标准品绘制的Real-time PCR标准曲线。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1用于猪链球菌种水平荧光定量PCR检测引物对和探针的

合成

针对猪链球菌种特异基因ackA序列，应用Beacon Designer7.0软件，设计出如表1所示的引物对和Taqman-MGB探针，由上海基康生物公司合成。

表1Real-time PCR引物和探针

实施例2猪链球菌种水平荧光定量PCR检测方法

1材料与方法

1.1菌株来源