[发明专利]一种检测克罗诺杆菌属菌株的方法及其试剂盒和引物

说明书

技术领域

本发明涉及微生物检测领域，具体涉及一种检测克罗诺杆菌属菌株的方法及其试剂盒和引物。

背景技术

克罗诺杆菌属(Cronobacter spp)是人和动物肠道内寄生的一种革兰阴性无芽孢杆菌。作为一种重要的食源性条件致病菌，克罗诺杆菌属菌株能够引起婴儿致命的感染，致死率高达10%-80%。它通常能导致婴儿严重的临床症状，例如脑脓疡，脑膜炎，坏死性小肠结肠炎和全身性败血症。曾经有在婴儿配方粉中分离到阪崎克罗诺杆菌菌株的报道。克罗诺杆菌属菌株是通过配方粉危害婴幼儿健康的重要条件性致病菌。新生婴儿或早产儿都存在通过食用污染有克罗诺杆菌属的婴儿配方粉而感染克罗诺杆菌属菌株的风险。在污染环节调查中发现,整个婴幼儿配方粉生产工艺流程中,可检测到克罗诺杆菌的污染点占到全部取样点的31%。因此，对克罗诺杆菌属菌株快速鉴定与鉴别是实现有效控制的基础。该菌在1980年被首次命名和定义后,又于2008年由一个种被重新分为克罗诺杆菌新属(Cronobacter spp.),属下分为5个新种(其中Cronobacter sakazakii称为新组合)、1个克罗诺杆菌基因种(Genomospeciese)和3个新亚种,尽管该菌的分类和名称已变,但目前检测仍然沿用程序式的阪崎肠杆菌标准检测方法,以传统生化反应进行鉴定,需要18-24h，而且无法区分为哪一种,这显然已经不能满足对克罗诺杆菌属菌株检测的需求。在鉴别方面,尽管已有扩增片段长度多态性分析(Amplified fragment length polymorphismas,AFLP)、16S rRNA全序列比较、DNA-DNA杂交实验及多位点测序等多种可靠方法，但这些根据遗传特征的分析方法耗时长、工作量大。因此，目前缺少对克罗诺杆菌属菌株的高效率的鉴定与鉴别方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于克服现有传统技术检测时间长的缺陷，提供一种克罗诺杆菌属菌株的PCR检测方法、核酸及引物对。采用本发明的检测方法检测克罗诺杆菌属菌株，检测时间短，成本低，更加具有实用性，检测结果特异，结果判定简单。

本发明的技术方案如下：

本发明的技术方案之一是：一种检测克罗诺杆菌属菌株的方法，包括以下步骤：

（1）提取待检样品的基因组DNA，以其为模板，以克罗诺杆菌属特异性扩增引物对为引物，进行PCR扩增，所述的引物对中，一条引物的序列为SEQ ID NO.1所示，另一条引物的序列为SEQ ID NO.2所示；和

（2）检测438bp位置单一扩增产物的存在。

根据本发明，步骤（1）中，所述PCR中，PCR的反应体系较佳的为：1×PCR反应缓冲液，10-15mmol/L Mg²⁺，0.2-0.3mmol/L dNTP，0.1-0.3μM引物1，0.1-0.3μM引物2，Taq酶0.01-0.1U/μL，DNA模板10-100ng/μL。更佳的为：1×PCR反应缓冲液，12.5mmol/L Mg²⁺，0.25mmol/L dNTP，0.2μM引物1（SEQ ID NO.1），0.2μM引物2（SEQ ID NO.2），Taq酶0.04U/μL，DNA模板50ng/μL。

步骤（1）中，所述PCR中，PCR的扩增程序较佳的为：92-95℃预变性3-6min，之后开始以下循环，每个循环的程序为：92-95℃变性20-40s，60-65℃退火20-40s，70-74℃延伸20-40s；循环共30-40个；循环结束后，70-74℃延伸8-12min，降温至4-15℃，结束。更佳的为：94℃预变性5min，之后开始以下循环，每个循环的程序为：94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸30s；循环共35个；循环结束后，72℃延伸10min，降温至12℃，结束。

步骤（2）中，所述的检测结果的判断方法如下：在检测的结果中，如果存在438bp位置的单一扩增产物，则说明待检样品中含有克罗诺杆菌菌属菌株；如果不存在438bp位置的单一扩增产物，则待检样品中不含有克罗诺杆菌属菌株。

步骤（2）中所述的检测方法，可以是本领域常规的方法，优选的为凝胶电泳检测法，可以是琼脂糖凝胶，也可以是聚丙烯酰胺凝胶。

本发明的方法尤其适用于检测食品中的克罗诺杆菌属菌株，特别是奶粉中的克罗诺杆菌属菌株的检测。