[发明专利]一种悬浮培养细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及医药生物领域，具体涉及一种悬浮培养细胞的方法。 

体外细胞的培养方法包括贴壁培养和悬浮培养，贴壁培养（是指细胞贴附在一定的固相表面进行的培养；悬浮培养通过振荡或转动装置使细胞始终处于分散悬浮于培养液内的培养方法；其中悬浮培养又可分为微载体悬浮培养及全悬浮培养。与贴壁培养相比，悬浮培养具有如下优点：（1）可连续扩大生产量；（2）有利于细胞培养基中的营养物质和气体充分接触，而且易于控制培养条件（温度、pH、氧分压和CO₂等)；（3）培养条件稳定，趋于均一，便于进行定量研究；（4）易于在连续密闭的系统中进行，减少了操作步骤和污染的机会；（5）可以长期连续培养，既可节省人力，又使细胞能持续维持在对数生长期；（6）悬浮培养的细胞仍保持原先对病毒的敏感性和生物学特性。基于上述优点，如何克服贴壁细胞培养时的缺点，充分利用悬浮培养的优点成为细胞培养中的重大难题。 

  

发明内容

针对以上不足，本发明提供了一种贴壁细胞进行悬浮培养的方法，本方法将贴壁细胞利用细胞融合技术进行悬浮培养，充分利用了悬浮培养的优点，使得贴壁细胞可以进行简化、高效、大量的培养。 

本发明是通过以下技术方案实现的： 

一种悬浮培养细胞的方法，其包括如下步骤：

（1）利用细胞融合技术将贴壁无限传代细胞系与有限传代悬浮细胞融合，建立既能无限传代又能悬浮培养的融合细胞系；

用方瓶贴壁培养从液氮中复苏的无限传代细胞系，培养条件为：pH7.0～7.2，温度36～37℃，培养基为细胞培养液；培养时间48～72h，细胞单层长至90%，细胞密度为3～6×10⁵cells/mL；

将方瓶中单层长至90%的细胞用EDTA-胰酶消化分散，加入10mL 血清浓度为15% 细胞培养液，终止消化获得细胞悬液，并进行细胞计数；

取与上述传代细胞数目相等的动物源性淋巴细胞，混合后进行800rpm离心10min，获得混合细胞泥；

将上述混合细胞泥以10mL无血清细胞培养液重悬，在800rpm下离心10min，重复洗涤1次，除去残余血清；

弹动离心管底，将离心获得的细胞泥散开，向管中加入浓度为50%的PEG 1mL，在1min内匀速加完，并边加边轻轻晃动；加入9mL无血清细胞培养液，混合均匀，1000rpm离心5min，弃上清；缓慢加入10mL无血清细胞培养液，重悬细胞，1000rpm离心5min，弃上清；加入5mL 血清含量为15% 的细胞培养液，重悬细胞，转入5mL一次性细胞培养瓶中，置37℃温箱培养；同时设正常淋巴细胞对照；

（2）筛选悬浮生长的融合细胞；

培养24h，用吸管轻轻吹打培养瓶底部3～5次，将培养液连同悬浮生长细胞转移至新的细胞培养容器，37℃培养；培养3～5天，培养过程中，每隔6～8h晃动一下培养容器，以便于细胞的生长，连续培养7天以上，重复上述步骤数次，除去贴壁生长细胞，获得完全悬浮生长的细胞。

将悬浮细胞在37℃连续培养7天以上，待残存的淋巴细胞或自身融合的淋巴细胞自然凋亡后，以获得无限传代细胞与淋巴细胞的融合细胞。 

（3）细胞稳定性的确定； 

上述步骤（2）细胞培养过程中培养3～4天，补加血清含量为15% 的细胞培养液1次；培养7天以上，获得完全悬浮生长的无限传代细胞与淋巴细胞的融合细胞，1000rpm离心5min，去上清，以新鲜培养液重悬，置于新的细胞培养容器中继续培养，传代1次；重复上述步骤，将细胞传10个代次以上，显微镜下观察。

上述步骤（3）中细胞培养温度：36～37℃、pH：7.0～7.4。 

本发明的有益效果是：本发明利用细胞融合技术将贴壁培养的细胞驯化为可悬浮培养的细胞，充分利用了悬浮培养的优点，为利用悬浮细胞获得目的产物奠定基础，本方法所驯化悬浮细胞可利用含有血清的普通细胞培养液进行培养，与无血清培养液相比，大大降低了培养成本。本方法采用全悬浮培养，与微载体悬浮培养相比有以下优势：无需昂贵的微载体，从而有效降低生产成本;可省去微载体培养中附加步骤如消化收获细胞等，从而简化生产过程，缩短生产时间，提高生产效率，并易于进行扩大培养。 

附图说明

图1为本发明显微镜下观察培养细胞的情况。