[发明专利]一种悬浮培养细胞的方法

权利要求书

1.一种悬浮培养细胞的方法，其包括如下步骤：

（1）利用细胞融合技术将贴壁无限传代细胞系与有限传代悬浮细胞融合，建立既能无限传代又能悬浮培养的融合细胞系：

用方瓶贴壁培养从液氮中复苏的无限传代细胞系，培养条件为：pH7.0～7.2，温度36～37℃，培养基为细胞培养液；培养时间48～72h，细胞单层长至90%，细胞密度为3～6×10⁵cells/mL；

将方瓶中单层长至90%的细胞用EDTA-胰酶消化分散，加入10mL 血清浓度为15% 细胞培养液，终止消化获得细胞悬液，并进行细胞计数；

取与上述传代细胞数目相等的动物源性淋巴细胞，混合后在800rpm下离心10min，获得混合细胞泥；

将上述混合细胞泥以10mL无血清细胞培养液重悬，在800rpm下离心10min，重复洗涤1次，除去残余血清；

弹动离心管底，将离心获得的细胞泥散开，向管中加入浓度为50%的PEG 1mL，在1min内匀速加完，并边加边轻轻晃动；加入9mL无血清细胞培养液，混合均匀，1000rpm离心5min，弃上清；缓慢加入10mL无血清细胞培养液，重悬细胞，1000rpm离心5min，弃上清；加入5mL 血清含量为15% 的细胞培养液，重悬细胞，转入5mL于一次性细胞培养瓶中，置37℃温箱培养；同时设正常淋巴细胞对照；

（2）筛选悬浮生长的融合细胞：

培养24h，用吸管轻轻吹打培养瓶底部3～5次，将培养液连同悬浮生长细胞转移至新的细胞培养容器，37℃培养；培养3～5天，培养过程中，每隔6～8h晃动一下培养容器，连续培养7天以上，重复上述步骤数次，除去贴壁生长细胞，获得完全悬浮生长的细胞；

（3）细胞稳定性的确定：

上述步骤（2）细胞培养过程中培养3～4天，补加血清含量为15% 的细胞培养液1次；培养7天，1000rpm下离心5min，去上清液，以新鲜培养液重悬，置于新的细胞培养容器中继续培养，传代1次；重复上述步骤，将细胞传10个代次以上，显微镜下观察。

2. 根据权利要求1所述的一种悬浮培养细胞的方法，其特征在于：所述步骤（3）中细胞培养温度：36～37℃、pH：7.0～7.4。