[发明专利]发酵法木聚糖酶的一种制备方法

权利要求书

1.发酵法木聚糖酶的一种制备方法，主要包括以下步骤：

1)复合诱变：将从土壤样品中分离的木聚糖酶产生菌株mtr127用无菌水制成孢子悬浮液，采用低能离子注入和DES进行诱变。经培养后，进行初筛和复筛，最终筛选出高酶活菌株MJT36(CGMCC No.6410)，并进行菌种的鉴定，保藏和传代试验。

2)发酵：将MJT36孢子悬液接入装有产酶培养基的三角瓶中，摇瓶振荡培养。

3)酶的分离纯化：①硫酸铵沉淀：发酵液低温离心后收集上清液(粗酶液)，加入固体硫酸铵，过夜后离心，收集沉淀；②疏水层析：用磷酸盐缓冲液溶解上述沉淀，加入固体硫酸铵，离心后上清液加入到用起始缓冲液平衡好的疏水柱中，硫酸铵缓冲液阶段洗脱，收集具有酶活性的酶液；③凝胶过滤层析：将收集的酶液用硫酸铵沉淀酶蛋白，离心后沉淀用磷酸盐缓冲液溶解，加入到用磷酸盐缓冲液平衡好的分子筛柱中，同一缓冲液洗脱和收集，检测酶活，合并具有较高酶活性的洗脱液；④阴离子交换层析：将收集的酶液用磷酸盐缓冲液透析，浓缩后上阴离子交换柱，用含NaCl的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱和分部收集，合并具有较高酶活性的洗脱液。

4)冷冻干燥：洗脱液用SephadexG-25脱盐、聚乙二醇浓缩，冷冻干燥后制得木聚糖酶，活性达到100000IU/g以上。

2.根据权利要求1所述的诱变方法，其特征在于：低能离子注入和DES复合诱变：注入离子选择诱变育种常用的N⁺，注入离子能量为10Kev、15Kev，N⁺注入量为5.6×10¹⁴ ions/cm²、1.12×10¹⁵ ions/cm²、1.62×10¹⁵ ions/cm²、2.12×10¹⁵ions/cm²、2.62×10¹⁵ ions/cm²共5个处理。DES溶液选择0.01％、0.05％2个浓度。

3.根据权利要求1所述的发酵条件，其特征在于：将1mLMJT36孢子悬液(10⁶个/mL)接入装有30、40、50、60、70、80mL产酶培养基(1、1.5、2、2.5、3g麸皮，0.1％的葡萄糖、蔗糖、木糖、木聚糖、淀粉，1％的蛋白胨、草酸铵、酵母粉、硫酸铵、柠檬酸三铵、尿素，0、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％吐温-80，0.2％KH₂PO₄，0.05％MgSO₄·7H₂O，起始pH4、5、6、7、8)的250mL三角瓶中，振荡培养60、72、84、96h。

4.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：硫酸铵沉淀后，用磷酸盐缓冲液溶解上述沉淀，加入固体硫酸铵，离心后上清液加入到用起始缓冲液平衡好的Phenyl-Sepharose CL-4B、Phenyl-Sepharose 6FF、Phenyl-Sepharose 4FF等疏水柱中，硫酸铵缓冲液阶段洗脱(流速0.4～0.6mL/min)。将收集的酶液用硫酸铵按55％、60％、65％、70％、75％、80％饱和度沉淀酶蛋白，离心后沉淀用磷酸盐缓冲液溶解，加入到用磷酸盐缓冲液平衡好的Sephadex G-25、G-50、G-70分子筛柱中，同一缓冲液洗脱(流速0.4～0.6mL/min)和收集。将收集的酶液用磷酸盐缓冲液透析，浓缩后上阴离子交换柱，用含NaCl的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱(流速0.4～0.6mL/min)和分部收集，合并具有较高酶活性的洗脱液。