[发明专利]一种呋喃它酮代谢物的化学发光检测试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测呋喃它酮代谢物（AMOZ）的化学发光免疫检测试剂盒，用于检测畜禽组织（肌肉、肝脏）和水产品中的AMOZ含量或残留量。属于免疫学检测领域。

背景技术

呋喃它酮属于硝基呋喃类抗菌药，在临床上主要用于鸡白痢、鸡大肠杆菌病、鸡球虫病等各种肠道感染性疾病的治疗及用作猪、禽类和水产促生长的添加剂。但有关研究证明，呋喃它酮及其代谢物具有相当大的毒性和副作用，能诱导有机体基因突变及致畸胎，且能诱发癌症。

欧盟早在1990年就颁布2377/90/EEC条例，将硝基呋喃类药物及其代谢物列为A类禁用药，规定其在动物源性食品中的最高残留量为1.0μg/kg。1995年起欧盟、日本、美国等开始禁止这类抗菌剂在食用的畜禽及水产动物中使用，并严格执行对输入的食用鱼、虾及禽类进行残留检测。中国农业部2002年2月发布《食品动物禁用的兽药及其他化合物清单》中，明文禁止在所有食品动物的所有用途中使用硝基呋喃类药物。但是，由于其价格便宜，药效好，在很多国家还在继续违规使用。为了保障人民健康及扩大与世界各国动物源性食品贸易往来，必须对动物源性食品中呋喃它酮进行检测。

由于呋喃它酮在体内很快就能被代谢，而在组织中结合的代谢产物(AMOZ)则能存留较长的一段时间，所以药残监测部门经常以检测其代谢产物-AMOZ为手段达到检测呋喃唑酮残留的目的。目前，呋喃它酮检测方法主要有微生物法、色谱法、免疫分析法等。微生物法是测定抗生素残留的经典方法，具有前处理简单、经济、批量大等优点，但精确度、准确度和特异性不高。色谱法应用较普遍，精确度和灵敏度高，但因其流程繁琐、设备昂贵、检测速度慢等原因，很难实现现场检测和普及推广。酶联免疫检测法具有简单、快速、处理样本量大、灵敏度较高、特异性强等诸多优点，被广泛应用于残留检测，但在实践中很容易出现各种各样的问题，如加样时间是否一致，洗板是否彻底，加样量是否一致等，导致易出现假阳性结果等缺点。

基于化学发光强度和被测物含量之问的关系建立的分析方法叫化学发光分析法。化学发光免疫分析包含两个部分，即免疫反应系统和化学发光分析系统。化学发光免疫检测方法具有特异性强、稳定快速、检测范围宽、操作简单自动化程度高、试剂稳定且有效期长(6~18个月)等优点，其检测限比酶联免疫法和理化检测方法高几个数量级。本研究旨在建立AMOZ残留化学发光酶联免疫检测试剂盒，为拥有自主知识产权检测产品技术的开发奠定基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种AMOZ的化学发光酶联免疫检测试剂盒。该试剂盒具有检测灵敏度高、应用灵活、方便的特点，可用于畜禽组织、肝脏和水产品中AMOZ的残留量检测。

为实现上述目的，本发明主要是利用抗原与抗体的特异性免疫反应的基本原理来实现的。化学发光免疫分析法是化学发光法和免疫分析法结合的产物，因此同时具有化学发光法的高灵敏性和免疫分析法的高特异性。在整个反应过程中，样品中AMOZ含量越高，反应体系中发光强度越弱；反之，样品中AMOZ含量越少，发光强度越高。

本发明的检测AMOZ的化学发光免疫检测试剂盒含有盒体，设在盒体内的化学发光板和设在盒体内的试剂。 具体含有以下成分：

包被有AMOZ偶联抗原的白色不透明96孔可拆卸或不可拆卸的聚苯乙烯化学发光板。

应用pH=7.4 0.05 mol/L的PBS溶液稀释AMOZ纯品得到的AMOZ系列标准品溶液，浓度范围至少包含了0.05~4.05ng/mL的浓度区间。

酶标抗体浓缩液。是由AMOZ与牛血清蛋白偶合制成的偶联物作为免疫原免疫Balb/c小鼠制备获得。

酶标抗体稀释液。pH7.6的0.01M的磷酸钠、0.25M的NaCl溶液。

发光底物液。发光底物液分为A、B液。A液为化学发光底物-鲁米诺和发光增强剂-对甲苯酚溶液，B液为过氧化氢脲溶液。

浓缩复溶液。浓缩复溶液具体为2倍浓缩磷酸盐缓冲液，使用前用双蒸水稀释至工作浓度后使用，用于样品前处理。

浓缩洗涤液。浓缩洗涤溶液具体为含有吐温-20（Tween-20）缓冲液的20倍浓缩磷酸盐缓冲液，使用前用双蒸水稀释至工作浓度后使用，用于实验过程中洗涤化学发光板。

衍生化试剂。2-硝基苯甲醛。

本发明溶液的配制：

本发明试剂盒中涉及的AMOZ标准品溶液、酶标抗体溶液、化学发光溶液及洗涤溶液及其配方对本发明试剂盒检测的灵敏度影响很大；其中各溶液的主要成分及其配制方法是：