[发明专利]芋螺毒素多肽Eb1.6的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种芋螺毒素多肽Eb1.6的制备方法。

背景技术

芋螺属腹足纲软体动物，全世界约有500余种，遍布世界各暖海区，我国有芋螺100多种，主要分布在西沙群岛、海南岛及台湾海域。芋螺多肽是由芋螺毒液管和毒囊内壁的毒腺所分泌，每种芋螺的毒液中含50-200个活性多肽，不同品种芋螺所含的活性肽各不相同，即使同种芋螺因海域不同，其毒素成分也可存在差异，理论上估计约存在5万多种不同活性的多肽（McIntosh JM，Jones RM.Toxicon，2001，39：1447-1451.）。α-芋螺多肽（α-CTX）属于芋螺多肽A超家族，特异作用于肌肉型或神经元型nAChRs。绝大多数α-芋螺多肽含12-18个氨基酸、两对二硫键（CCXmCXnC，连接方式为1-3，2-4）。根据m，n的数目不同，α-芋螺多肽细分为α3/5，α4/3，α4/4，α4/6，α4/7亚家族。目前发现某些α-芋螺多肽具有镇痛活性，其中α-芋螺多肽Vc1.1(GCCSDPRCNYDHPEICONH2)是来自维多利亚芋螺（Conus Victoriae），由16个氨基酸组成，含两对二硫键（二硫键的排列方式为1-3，2-4）（Sandall et al.Biochemistry，2003，42：6904-6911.）。研究表明Vc1.1在神经性疼痛动物模型中表现出了较好的镇痛活性并具有加速损伤神经恢复的作用（Satkunanathan et al.Brain Res.，2005，1059：149-158），2006年已进入临床研究阶段。α-芋螺多肽作用的靶点与传统镇痛药物的靶点不同，且不成瘾，这对开发新一代镇痛药物具有重要意义。

Eb1.6（GCCSNPACMLKNPNLC-NH₂，序列1）来自中国南海西沙群岛黑星芋螺，由-芋螺毒素信号肽保守序列克隆得到，其序列与已报道的α-芋螺毒素显著不同。前期初步研究表明，该肽对大鼠神经病理性疼痛模型具有很强的镇痛作用（刘珠果等..型芋螺多肽及其应用，中国发明专利申请号：ZL201010121879.7）。前期合成Eb1.6采用仪器合成，缩合剂为N,N’-二环己基碳二酰亚胺（DCC）/1-羟基苯并三唑（HOBt），偶合率高。但该方法不利于手工大量合成，因为缩合剂DCC反应后形成不溶于N,N-二甲基甲酰胺（DMF）或二氯甲烷（DCM）的N,N’-二环己基脲（DCU），给缩合反应及树脂洗涤带来不便。另外，Eb1.6线性肽折叠成目标物质采用C18柱反相吸附，乙腈洗脱，成本高。

发明内容

本发明的目的是提供一种制备芋螺多肽Eb1.6（GCCSNPACMLKNPNLC-NH₂）的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1）采用缩合剂DIC/HOBt合成Eb1.6线性肽；2）折叠Eb1.6线性肽得到多肽粗品；

3）纯化所述多肽粗品；即得到芋螺多肽Eb1.6。

上述方法中，采用缩合剂DIC/HOBt合成Eb1.6线性肽包括如下步骤：先用Fmoc保护氨基酸、以Rink树脂为固相载体、DIC/HOBt为缩合剂、哌啶为脱保护剂，从C端依次偶联合成，得到肽树脂；再将所述肽树脂裂解得到Eb1.6线性肽。其中，Fmoc保护氨基酸为Fmoc-Cys(Trt)–OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Pro-OH和Fmoc-Ser(tBu)-OH。

上述合成Eb1.6线性肽方法中，摸索选用了缩合剂苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU）/HOBt/异丙基二乙胺（DIEA），发现仪器与手工合成目标肽均较杂，产率低。最后采用缩合剂DIC/HOBT，仪器合成与手工合成的效率均很高。

上述合成Eb1.6线性肽方法中，步骤1）中，所述Rink树脂和每一个所述Fmoc保护氨基酸的摩尔比为1:4。

上述方法中，折叠Eb1.6线性肽按照包括如下步骤的方法进行：

（a）将Eb1.6线性肽在浓度为0.1-0.3M、pH值为8.0-8.4的缓冲液中折叠；所述缓冲液为碳酸氢铵缓冲液或醋酸铵缓冲液或Tris缓冲液；

（b）将经步骤（a）得到的折叠产物经AmberliteXAD16大孔吸附树脂吸附后，用无水乙醇浸洗，收集浸洗产物，即得到多肽粗品。