[发明专利]具有增加的稳定性的突变型乳酸氧化酶以及涉及其的产品、方法和用途

说明书

本发明涉及具有增加的稳定性的突变型乳酸氧化酶（lactate oxidase）、编码突变型乳酸氧化酶的核酸、包含所述核酸的表达载体、包含所述核酸或所述表达载体的宿主细胞、测定样品中的乳酸的方法、突变型乳酸氧化酶用于测定乳酸的用途、使用所述突变型乳酸氧化酶用于测定样品中的乳酸的装置和包含所述突变型乳酸氧化酶用于测定乳酸的试剂盒。

乳酸（lactic acid）也称为乳酸（milk acid），在几个生物化学过程中起作用。乳酸是具有化学式C₃H₆O₃的α羟酸。在溶液中它以其离子形式存在，即作为乳酸根（lactate）CH₃CH（OH）COO^?。乳酸（lactate）是手性的，并且具有2种光学异构体。一种称为L-（+）-乳酸或（S）-乳酸，并且另一种称为D-（?）-乳酸或（R）-乳酸。L-（+）-乳酸是生物学重要的异构体。

在动物（包括人）中，L-乳酸（L-lactate）在正常代谢和运动过程中经由酶乳酸脱氢酶（LDH）由丙酮酸（pyruvate）不断产生。它通常直到乳酸生产率超过乳酸去除率才在浓度中增加，这由许多因素支配，包括单羧酸转运蛋白、LDH的浓度和同种型、和组织的氧化能力。在人中，血液乳酸的浓度在静止时通常是1–2 mmol/L，但在激烈运动过程中可以升高至超过20 mmol/L。

乳酸浓度或乳酸与丙酮酸比反映氧化还原态。因此，监控乳酸水平是在组织需氧量和利用之间的平衡的良好指示剂，并且当研究细胞和动物生理学是有用的。相应地，可以监控在生物学样品例如血清、血浆、血液、尿和唾液中的乳酸或在细胞培养样品中的细胞内和细胞外乳酸浓度，以便研究或监控受试者或细胞的状况。

血液乳酸的测定频繁用于竞争性体育运动、健身和康复中，允许：

● 个体运动强度的评估

● 运动和恢复期的改善

● 超负荷和损伤的危险减少

如上文详述的，无氧糖酵解显著增加血液乳酸，尤其是对于延长运动。

在医学中，乳酸的测定可以用于

● 测定组织缺氧

● 测定疾病的严重性和预后，到由乳酸水平反映的程度。

例如，乳酸浓度可以在降低机体可用的氧量、增加乳酸生产和/或降低乳酸清除率的任何状况下增加。这可以是从由于剧烈运动在肌肉中产生的乳酸的局部增加直到威胁生命的全身休克的任何事情。过量乳酸可以存在于一系列疾病、感染和遗传性代谢和线粒体病症中。关于增加的血液乳酸的常见原因是起因于此类状况例如休克、肺炎和充血性心力衰竭的缺氧。乳酸酸中毒还可以在肾衰竭和白血病中出现。此外，硫胺素缺乏病和糖尿病酮症酸中毒与增加水平的乳酸相关。它们还可以通过特定药物例如二甲双胍（由糖尿病患者服用）和异烟肼（肺结核治疗）引起。

用于测定乳酸的测试是本领域已知的。近年来，用于测定乳酸的酶促方法已得到开发。酶促方法涉及在测定方法中酶的使用，并且一般是简单的且提供更大的特异性、准确度和重现性。对于乳酸测定描述的第一种酶促方法基于通过乳酸脱氢酶从乳酸到铁氰化钾的氢转移。然而，该程序是麻烦的且未受到广泛承认。后续方法涉及NADH形成的UV测量。在1974年，描述了测量通过由乳酸脱氢酶催化的乳酸氧化形成的NADH的乳酸程序，使用肼作为用于丙酮酸的捕获剂。另一种方法还基于乳酸脱氢酶的催化作用，但在反应混合物中包括丙氨酸转氨酶，以更快速地去除由乳酸转换形成的丙酮酸。另外一种方法使用涉及乳酸氧化酶的酶促反应，以将乳酸转换为丙酮酸。通过这种反应产生的过氧化氢随后可以用于酶促反应中，以生成有色染料。

来自绿浅气球菌（Aerococcus viridans）的乳酸氧化酶通常用于生物传感器和体外测试中，以便检测例如在血液中的乳酸。这些生物传感器和体外测试占优势地用于例如重点护理患者和运动员的监控中。传感器的寿命由乳酸氧化酶的稳定性决定，所述乳酸氧化酶在使用和贮存期限过程中变得失活。此外，用于体外测试的试剂的贮存期限和使用中时间受乳酸氧化酶的稳定性影响。因此，增加乳酸氧化酶的稳定性具有很大利益，以便增加生物传感器和体外测试的贮存期限和使用中时间。相应地，本发明的目的是提供具有增加的稳定性的乳酸氧化酶。

令人惊讶的是，已发现在SEQ ID NO: 1的乳酸氧化酶的氨基酸序列的位置191上的酪氨酸突变增加乳酸氧化酶的稳定性。