[发明专利]碱性果胶酶突变体及其重组表达工程菌

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种碱性果胶酶突变体及其重组表达工程菌。 

技术背景

果胶酶是指能催化果胶质分解的多种酶的总称，对果胶质结构化学的研究表明，果胶质的化学结构比较复杂，能催化其分解的果胶酶也是种类繁多。根据分解糖苷键的反应性质或降解底物的性质，果胶酶可以分为3类：果胶水解酶、果胶裂解酶和果胶酯酶。果胶酶按其作用最适pH分为酸性果胶酶和碱性果胶酶。目前研究和应用最多的是酸性果胶酶，主要用于水果榨汁和果汁澄清。 

碱性果胶酶是在碱性范围内具有较高活性的果胶酶，在造纸、纺织等行业有着巨大的应用前景，已经引起广泛的关注。碱性果胶酶可用于棉麻织物杂质的有效去除，提高织物润湿性，且不会像纤维素酶那样降低棉纤维的强度。以碱性果胶酶为主要成分的脱胶酶，在苎麻、亚麻等麻类植物的脱胶工艺中的应用也越来越受到重视，可以不破坏植物纤维，不污染环境、节约能源。但现有碱性果胶酶，酶活水平普遍较低，只有几十个酶活单位，且碱性果胶酶对过氧化氢的耐受性低，不能满足工业生产的需要。 

目前工业上多采用构建重组表达工程菌株的方法来提高酶制剂的产量，常用的有大肠杆菌、毕赤酵母、曲霉、枯草芽孢杆菌等表达系统，其中枯草芽孢杆菌发酵周期短、工艺成熟，因此得到广泛使用。 

发明内容

本发明的目的是提供一种碱性果胶酶突变体及其重组表达工程菌，即通过随机突变的方法对来源于枯草芽孢杆菌的碱性果胶酶基因进行改造，获得了酶活水平极大提高的突变体。同时，突变体的酶学性质也比突变前有了很大的改进，为碱性果胶酶的产业化提供了有力的支持。 

本发明的一个方面涉及一种碱性果胶酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:4；其编码核苷酸序列为SEQ ID NO:3。 

本发明另一个方面涉及一种重组载体，所述的重组载体为携带有序列为SEQ ID NO:3的核苷酸片段的表达载体。 

上述的表达载体为原核表达载体。 

本发明的另一方面涉及一种枯草芽孢杆菌工程菌，该工程菌携带有能表 达上述碱性果胶酶突变体的表达载体。 

所述枯草芽孢杆菌工程菌株，命名为Bacillus subtilis PL113，已于2012年8月31日，保藏于地址为北京市朝阳区北辰西路 1号院 中科院微生物研究所(邮编:100101)的中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为：CGMCC NO：6489。 

本发明另一方面涉及上述工程菌株的应用，用于生产碱性果胶酶突变体。 

本发明还涉及上述碱性果胶酶突变体在纺织等领域的应用。 

本发明的碱性果胶酶突变体在枯草芽孢杆菌168中的表达量高达1140U/mL，是突变前的40多倍，且具有更好的酶学性质，对温度、pH和双氧水的耐受性都得到很大的提高。本发明的碱性果胶酶突变体最适作用温度为60℃，60℃处理20min后，仍能保留38%的酶活，是突变前的4倍；最适pH为9.0，在pH9.0条件下，60℃处理1h，仍能保留64.7%的酶活，是突变前的5.7倍；在含H₂O₂10g/L的缓冲体系中处理60min，仍能保留31.3%的酶活，是突变前的3.8倍。 

附图说明

图1：表达载体pWB980-PL113的构建示意图； 

图2：碱性果胶酶突变体相对酶活-温度变化曲线图； 

图3：碱性果胶酶突变体相对酶活-pH变化曲线图。 

具体实施方式

下面结合实例对本发明的方法做进一步说明。但实例仅限于说明，并不限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook）等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。 

实施例1碱性果胶酶基因PL的克隆 

一、枯草芽孢杆菌CGMCC1.897染色体的提取 

所述枯草芽孢杆菌CGMCC1.897购自“中国普通微生物菌种保藏管理中心”，分类命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），保藏号为：CGMCC1.897。 

，挑取新鲜的枯草芽孢杆菌CGMCC1.897单菌落于5mL LB液体培养基中，37℃摇床200rpm振荡培养过夜，按照Tiangen细菌基因组提取试剂盒（天根生化科技有限公司）的说明提取染色体。