[发明专利]一种百合ANS基因及其克隆方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因及其克隆方法，尤其是百合ANS基因及其克隆方法。

背景技术

花色是花卉最重要的性状之一，它主要由类黄酮、类胡萝卜素、生物碱三大类色素决定。类黄酮是大多数花色形成的决定性色素群，它存在于花瓣表皮细胞液中，其中花青素属红色系，其他均属黄色系；类胡萝卜素主要呈现黄色、橙色或红色，它广泛存在于植物的花、叶、果皮和根等部位；生物碱则参与花瓣黄色、橙色及红色的形成。这三大类色素的合成都有众多的结构基因及调控基因参与，包含了多个代谢步骤，作用机理较复杂。

传统的花色育种费时费力，而且有很大的局限，研究花色基因，对于通过分子育种手段来人工修饰改变花卉颜色具有非常重要的意义，如可通过直接导入外源结构基因或调节基因、利用反义技术和共抑制原理等等方法来达到改变花色的目的。另外，由于花色直观可见，因此它也是研究基因表达调控和基因互作的热点和基础方向。

目前对属于类黄酮的花青素的合成代谢和参与其中的基因研究得较为深入，而对类胡萝卜素等其它色素的研究相对较少。花青素最常见的是矢车菊色素(cyanidin)、飞燕草色素(delphinidin)和天竺葵色素(pelargonidin)，它们主要积累在花瓣表皮细胞的液泡中，控制花的红色、紫罗兰色及蓝色等颜色变化，其含量的增高或降低，都可能改变花的颜色。影响花青素代谢的基因有两类：一类是不同植物共同具有的结构基因，它们对应的酶有查尔酮合成酶(chalconesynthase，CHS)、查尔酮异构酶(chalcone isomerase，CHI)、黄烷酮3-羟化酶(flavanone 3-hydroxylase，F3H)、二羟基黄酮醇还原酶(dihydroflavonol 4-reductase，DFR)、花色素苷合成酶(anthocyanidin synthase，ANS)以及类黄酮3-O-糖基转移酶(flavonoid3-O-glucosyltransferase，UFGT)等等，它们直接编码花色素代谢生物合成酶；另一类是调节基因，目前分为myc转录因子和myb转录因子两大类，它们负责控制结构基因表达强度和程式。

ANS位于花青素合成通路末端，主要作用是催化无色花色素转化成有色花色素：前体物质丙二酰辅酶A和香豆酰辅酶A被CHS和CHI催化形成无色的黄烷酮，黄烷酮在F3H的作用下形成无色的二羟基黄酮醇，二羟基黄酮醇再被DFR催化还原形成不稳定的无色花色素，然后在ANS和UFGT协同作用下合成各类花色素苷。

ANS基因首先是通过转座子标签技术从玉米突变体中分离得到的，研究表明ANS和F3′H一样，属于2-酮戊二酸双加氧酶家族，类黄酮合成途径中的黄酮醇合成酶(flavonol synthase，FLS)也属于此家族，它和ANS具有保守的同源关系。Rosati等从美国金钟连翘(Forsythia×intermedia cv.“Spring Glory”)中克隆得到了ANS基因和其启动子，并证明在美国金钟连翘的花瓣中无花色素苷是由于缺少ANS基因的表达所导致的。目前，已经从众多花卉中克隆得到了ANS基因，如郁金香(Tulipa gesneriana)、文心兰(Oncidium Gower)、大丽菊(Dahlia pinnata)、瓜叶菊(Senecio cruentus)、芍药(Paeonia lactiflora)等等，但迄今为止，还未见从百合中克隆到该基因的报道。

百合(lilium spp.)是百合科百合属(Lilium)的所有种的总称，它是世界著名的观赏花卉之一，有“球根花卉之王”的美誉。英国皇家园艺学会(RHS)和北美百合学会(NALS)按照百合栽培品种和其原始亲缘种与杂种的遗传衍生关系分为9大类，其中的三类：亚洲百合杂种(Asiatic hybrids)、麝香百合杂种(Longiflorum hybrids)和东方百合杂种(Oriental hybrids)目前在我国栽培较多。这其中，东方百合系列以其茎杆挺拔、花朵硕大、色彩丰富、芳香宜人的特点备受消费者欢迎，成为市面上主要的百合切花种类。目前对东方百合的研究主要集中在栽培技术、组织培养、采后生理等方面，基因克隆方面的研究较少。本实验采用同源克隆的方法，设计兼并引物和特异性引物，通过RACE法从东方百合‘Justina’的花蕾中分离得到了ANS基因的全长序列。这将为进一步探索百合不同花色的形成原因和分子机制，采用分子育种手段进行百合花色育种奠定基础。

发明内容

本发明的目的之一是通过以下技术方案来实现的：