[发明专利]一种百合ANS基因及其克隆方法

权利要求书

1.一种百合ANS基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种百合ANS基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示。

3.一种百合ANS基因克隆方法，其特征在于按下列步骤进行：

(1)提取以及纯化百合花瓣RNA，合成cDNA第一链；

(2)应用一对引物通过聚合酶链式反应对百合cDNA第一链进行扩增，所述引物为：

ANS-F1：TGGGGRGTSATGCAYATTGTGAACC

ANS-R1：TCCTTCGGCGGHTCGCRRAACACWGC

(3)应用3′RACE引物对聚合酶链式反应产物进行3′RACE克隆，据测序所得的ANS基因保守区序列设计3′RAC外引物和内引物：

3′GSP：ACTATCCCAAATGTCCGCAACC

3′NGSP：GCTCTACTATGGTGGCAAATGGGTC

(4)应用5′RACE引物对聚合酶链式反应产物进行5′RACE克隆，据测序所得的ANS基因保守区序列设计5′RAC外引物和内引物：5’GSP：GCCAATGTGGACGAGAAGCGAA

  5’NGSP：CAGGTTGCGGACATTTGGGATAGTAGTT

(5)ANS基因cDNA全长克隆，用Seqman软件将所得到的保守序列、3’端序列和5’端序列进行拼接，得到A基因的cDNA全长序列，共1356个碱基，设计引物进行全长验证，引物序列如下： 

A-forward：CCATTCTACTCCCATCAACC

A-reverse：TATTTCGTAATCCCCCTCTA。

4.如权利要求3所述的百合ANS基因克隆方法，其特征在于：

对百合cDNA第一链进行扩增的PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性40sec，57.1℃退火30sec，72℃延伸40sec，35cycles，72℃延伸10min，4℃forever。

3’RACE克隆的outter PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性40sec，54℃退火30sec，72℃延伸60sec，20cycles，72℃延伸10min，4℃forever。

3’RACE克隆的inner PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性40sec，57.1℃退火30sec，72℃延伸60sec，30cycles，72℃延伸10min，4℃forever。

5’RACE克隆的outter PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性40sec，59.9℃退火30sec，72℃延伸70sec，20cycles，72℃延伸10min，4℃forever。

5’RACE克隆的inner PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性40sec，60.9℃退火30sec，72℃延伸70sec，30cycles，72℃延伸10min，4℃forever。

全长克隆的PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性40sec，48.8℃退火30sec，72℃延伸80sec，35cycles，72℃延伸10min，4℃fofever。