[发明专利]筛选醛糖还原酶抑制剂的方法

说明书

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种筛选醛糖还原酶抑制剂的方法。

背景技术

醛糖还原酶主要存在于晶状体、血管、神经、红细胞以及肾脏等组织中，属于还原型辅酶Ⅱ(NADPH)依赖的醛-酮还原酶超家族。它是体内多元醇代谢途径的限速酶，可以催化多种亲水性的醛还原为相应的醇。在体内，醛糖还原酶催化底物葡萄糖还原生成山梨醇。

在糖尿病病人体内的高血糖生理环境下，醛糖还原酶被激活引发多元醇通路，山梨醇的细胞膜通透性较差造成组织内山梨醇聚积，引发白内障、视网膜病变、肾脏病变等慢性并发症。目前，由日本Ono制药公司1992年上市的依帕司他(Epalrestat)作为醛糖还原酶抑制剂被批准使用于临床，用于治疗糖尿病性神经病变，但是它还没有获得美国食品药物管理局(Food and Drug Administration，FDA)的批准。所以寻找醛糖还原酶抑制剂和研究醛糖还原酶抑制剂在临床中的应用对于开发新药有着非常重要的意义。

现有醛糖还原酶抑制剂的筛选一般使用紫外光谱法，其是以DL-甘油醛为底物，利用辅酶NAD(P)H在340nm处有特征吸收这一特点，根据反应体系在340nm处吸光度的变化进行抑制剂的筛选(Chihiro Nishimura, Takashi Yamaoka, Masakazu Mizutani, Kamejiro Yamashita, Tai Akera, Tsuyoshi Tanimoto. Purification and characterization of the recombinant human aldose reductase expressed in baculovirus system. Biochimica et Biophysica Acta, 1991, 1078, 171-178)。

光谱法筛选酶抑制剂使用DL-甘油醛为底物，与人体葡萄糖环境有较大差异，且由于在溶液中NAD(P)H自然氧化引起吸光度的变化，使得光谱法灵敏度低，且在340nm处吸光度容易受外界干扰，引起假阳性和假阴性结果(Arjen R. de Boer, Henk Lingeman, Wilfried M.A. Niessen, Hubertus Irth. Mass spectrometry-based biochemical assays for enzyme-inhibitor screening. Trends in Analytical Chemistry, 2007, 26, 867-883.)。

现代质谱仪的高精确度和灵敏度为我们提供了不受干扰的分子指纹图谱，串联质谱高度特异性和精确性揭示待分析化合物的结构信息，且质谱方法可以同时检测和定量多种组分，近年来在药物筛选中得到了广泛的应用(Gejing Deng, Gautam Sanyal. Applications of mass spectrometry in early stages of target based drug discovery. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2006, 40, 528-538)。但现有技术中还未有用质谱检测方法筛选醛糖还原酶抑制剂的方法。

酶促反应缓冲液中往往含有不挥发的盐和为保持酶活性稳定的添加物，盐和添加物可能会污染质谱仪的离子源并导致离子化抑制，样品进入质谱前使用高效液相色谱进行分离可以避免反应体系中的盐和添加物对检测的影响(Arjen R. de Boer, Thomas Letzel, Danny A. van Elswijk, Henk Lingeman,Wilfried M. A. Niessen,Hubertus Irth. On-Line Coupling of High-Performance Liquid Chromatography to a Continuous-Flow Enzyme Assay Based on Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Anal. Chem. 2004, 76, 3155-3161)。

发明内容

为了解决现有筛选醛糖还原酶抑制剂技术中，光谱法灵敏度低、容易受外界干扰的技术问题，本发明提供一种筛选醛糖还原酶抑制剂的方法，应用本发明筛选醛糖还原酶抑制剂精确度高、特异性好。

本发明提供的筛选醛糖还原酶抑制剂的方法，包括以下步骤：

(1)酶促反应缓冲液的配制