[发明专利]筛选醛糖还原酶抑制剂的方法

权利要求书

1.筛选醛糖还原酶抑制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)酶促反应缓冲液的配制

缓冲液是pH值为6.0-6.4的醋酸铵水溶液；

(2)标准品的配制

将山梨醇分别配成浓度为0.1微摩尔/升、0.2微摩尔/升、0.5微摩尔/升、1微摩尔/升、2微摩尔/升、5微摩尔/升、10微摩尔/升、20微摩尔/升、50微摩尔/升的标准品溶液，且每个浓度的标准品溶液均含1微摩尔/升的木糖醇作为内标；

(3)空白样品和样品的酶促反应

空白样品：反应总体积200微升，含有体积为30微升的醛糖还原酶、终浓度5毫摩尔/升的2-巯基乙醇、终浓度150微摩尔/升的NADPH、终浓度10毫摩尔/升的底物葡萄糖，其余以缓冲液补足；

样品：反应总体积200微升，含有体积为30微升的醛糖还原酶、终浓度5毫摩尔/升的2-巯基乙醇、终浓度150微摩尔/升的NADPH、终浓度0.1-50微摩尔/升的待测物、终浓度10毫摩尔/升的底物葡萄糖，其余以缓冲液补足；

空白样品和样品在25-40摄氏度反应15-40分钟，分别加入甲醇或乙腈终止反应，分别加入终浓度为1微摩尔/升的内标木糖醇；

(4)标准品、空白样品和样品的检测

对(2)中的标准品进行超高效液相色谱和质谱检测，从总离子流图中提取山梨醇和木糖醇的色谱图，分别积分求峰面积，以标准品浓度为横坐标，以山梨醇与木糖醇峰面积比值为纵坐标，或以标准品浓度为纵坐标，以山梨醇与木糖醇的峰面积比值为横坐标，得到山梨醇浓度的线性方程；

对空白样品、样品溶液进行超高效液相色谱和质谱检测；

所述的超高效液相色谱的检测条件：

色谱柱： Waters ACQUITY UPLC BEH  C18  2.1×50毫米，1.7微米；

流动相：甲醇和水； 

等度洗脱程序：0-2 分钟，20%甲醇，所指的百分比均为体积百分比；

流速：0.2毫升/分钟；

进样量：3微升；

所述的质谱检测条件：

毛细管电压：3000伏特；

去溶剂气氮气温度：350摄氏度；

锥孔电压：14伏特；

去溶剂气氮气流速：800升/小时；

锥孔气氮气流速：60升/小时；

碰撞气氩气流速：0.15毫升/分钟；

(5)待测物对醛糖还原酶的抑制率

分别计算空白样品、样品中山梨醇峰面积和内标木糖醇峰面积的比值，根据(4)得到的线性方程，求得空白样品和样品中山梨醇的浓度，计算出待测物对醛糖还原酶的抑制率。

2.根据权利要求1所述的筛选醛糖还原酶抑制剂的方法，其特征在于，所述的缓冲液的pH值为6.2。

3.根据权利要求1所述的筛选醛糖还原酶抑制剂的方法，其特征在于，所述的缓冲液由醋酸铵和醋酸配制而成，缓冲液浓度为100毫摩尔/升。

4.根据权利要求1所述的筛选醛糖还原酶抑制剂的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的标准品溶液是由缓冲液和甲醇配制而成的，或由缓冲液和乙腈配制而成的。

5.根据权利要求1所述的筛选醛糖还原酶抑制剂的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的样品中待测物的终浓度为10-50微摩尔/升。

6.根据权利要求1所述的筛选醛糖还原酶抑制剂的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的空白样品和样品在37摄氏度反应25分钟。

7.根据权利要求1所述的筛选醛糖还原酶抑制剂的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的甲醇或乙腈的体积为800-1000微升。