[发明专利]一种体外准确检测KRAS基因突变的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测KRAS基因突变的方法。

背景技术

基因突变是指基因组DNA分子在结构功能上发生碱基组成或排列顺序的改变，主要包括碱基的替代和片段的插入缺失，是导致基因型疾病的重要原因之一。基因突变分析在生物医学研究中，尤其是在基因型疾病诊断及病理研究中有着非常重要的作用。KRAS基因编码的蛋白参与由表皮生长因子受体(EGFR)介导的细胞信号转导通路，影响细胞的增殖、生长和转移；正常的KRAS基因编码的蛋白在接受上游信号活化后被激活，并将在信号传递给下游细胞因子后恢复非激活状态；而突变的KRAS基因所编码的蛋白无需上游信号活化便始终处于激活状态，导致细胞的非正常增殖和生长，引起恶性肿瘤。抗EGFR类肿瘤药物通过特异性阻滞EGFR与受体结合，阻断细胞转导通路，从而达到抑制癌细胞增殖的目的；多项研究发现，接受抗EGFR药物治疗的结直肠癌患者中，KRAS基因野生型的病人较KRAS基因突变型病人更能从治疗中受益：具有更高的药物客观反应率和较长的生存时间。因此，能够准确检测KRAS突变状态对指导结直肠癌患者临床用药有重要意义。人类KRAS基因的突变主要发生该基因第二号外显子上，其中最常见的突变有G12S、G12R、G12C、G12A、G12D、G12V、G13D7种形式。

传统检测KRAS基因突变的方法多种多样，其中最为经典是双脱氧测序技术，此外还包括等位基因特异性寡核苷酸杂交(ASO)、连接酶检测反应(LDR)、多聚酶链限制性长度多态性分析(PCR-RFLP)和TaqMan技术。虽然这些方法能够检测突变是否存在，但大多数方法不能确定突变的类型并且只能检测到突变的一部分；同时大多数方法需要琼脂糖凝胶电泳等PCR后处理检测才能分析结果，准确度和灵敏度受到限制。近年来，蝎型引物(Scorpion primers)、高分辨溶解曲线(HRM)、变性高效液相色谱分析(dHPLC)和焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)等方法技术改善了检测的灵敏度和特异性，但仍存在耗材昂贵，假阳性现象严重和操作繁琐等缺点。

等位基因特异性PCR(Allele-specific PCR)，也称为ARMS(Amplification refractory mutation system)技术，是一种利用特异性引物对模板进行选择性扩增而达到检测基因突变的方法。其原理是根据PCR过程中DNA聚合酶引导的引物延伸从3'末端开始，所以引物3'末端的碱基与模板的互补程度强烈影响聚合酶的识别作用和PCR反应的进行:若这个碱基与模板正常互补配对(A-T,G-C)，则引物可以不间断延伸，PCR得以高效进行，得到完整的产物；反之，若这个碱基与模板非正常配对，则引物的延伸受到阻滞，PCR效率大大降低。故只需将与突变位点对应的碱基放置在引物的3'末端，当用突变型特异性引物进行PCR扩增时，只要突变型模板可以得到扩增，而野生型模板的扩增受到了抑制。SYBR Green是一种DNA结合染料，可以非特异性与DNA双链小沟结合。在游离状态下SYBR Green只有本底水平荧光，而与DNA结合后其荧光强度增强1000倍以上。PCR反应过程中，产物成指数形式扩增，荧光强度也随之倍增，起到实时监测作用。传统的等位基因PCR法特异性不足，常常出现假阳性现象，使得检测结果不准确。

发明内容

为了克服传统等位基因特异性PCR法特异性不足，存在假阳性现象的缺点，本发明提供了一种体外准确检测KRAS基因突变的方法，通过设计高特异性引物与延伸阻滞引物，结合快速PCR法实现体外准确检测KRAS突变。

为实现以上发明目的，本发明的基本技术方案如下：

一种体外准确检测KRAS基因突变的方法，包括以下步骤：

（1）等位基因特异性引物的设计及合成

针对KRAS基因第二号外显子典型的7种突变分别设计等位基因特异性引物，作为上游引物；序列信息如下：

G12S5'-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCcA-3'    (24nt)

G12R5'-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCaC-3'    (24nt)

G12C5'-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCcT-3'    (24nt)

G12D5'-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTcA-3'   (25nt)

G12A5'-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTaC-3'   (25nt)