[发明专利]一种体外准确检测KRAS基因突变的方法

权利要求书

1.一种体外准确检测KRAS基因突变的方法，包括以下步骤：

（1）等位基因特异性引物的设计及合成

针对KRAS基因第二号外显子典型的7种突变分别设计等位基因特异性引物，作为上游引物；序列信息如下：

G12S5'-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCcA-3'    (24nt)

G12R5'-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCaC-3'    (24nt)

G12C5'-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCcT-3'    (24nt)

G12D5'-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTcA-3'   (25nt)

G12A5'-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTaC-3'   (25nt)

G12V5'-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTcT-3'   (25nt)

G13D5'-ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTcA-3'    (24nt)；

针对KRAS基因第二号外显子典型的7种突变设计共同的下游引物为延伸阻滞引物；序列信息如下

延伸阻滞引物(38nt)：

（2）模板的准备

提取被测样本的KRAS基因组DNA；另制取野生型基因组DNA；

（3）实时荧光PCR

针对步骤（1）中的7种特异性引物，建立被测样本、野生型模板的反应体系；

被测样本的每个反应体系中均加入被测样本的KRAS基因组DNA、特异性引物和延伸阻滞引物；野生型模板的每个反应体系中均加入野生型基因组DNA、特异性引物和延伸阻滞引物；

将配制好的各反应体系在荧光实时定量PCR仪上进行扩增，观察比较特异性引物对应的被测样本、野生型模板的反应体系的扩增曲线，判断被测样本中是否发生了KRAS突变。

2.根据权利要求1所述的体外准确检测KRAS基因突变的方法，其特征在于：所有反应体系中还均加有UNG酶和2×SYBR Green Mastermix。

3.根据权利要求2所述的体外准确检测KRAS基因突变的方法，其特征在于，步骤（3）的反应体系采用以下两种模式之一：

a模式：针对每一种特异性引物，均分别建立被测样本、野生型模板的反应体系；

b模式：将7种特异性引物分为三类；其中，G12S、G12R、G12C为一类，G12A、G12D、G12V为一类，G13D为一类；针对这三类特异性引物，均分别建立被测样本、野生型模板的反应体系。

4.根据权利要求3所述的体外准确检测KRAS基因突变的方法，其特征在于：

以每个反应体系的总量20μl计，采用上述a模式，则：加入特异性引物200nM-500nM、延伸阻滞引物200nM-500nM，UNG酶0.2U，2×SYBR Green Mastermix10μl，ddH2O补足体积20μl；

或者，以每个反应体系的总量20μl计，采用上述b模式，则：将G12S、G12R、G12C上游引物按200nM:200nM:300nM比例混合，再加入所述延伸阻滞引物300nM构成混合引物体系；将G12A、G12D、G12V上游引物按200nM:200nM:300nM比例混合，再加入所述延伸阻滞引物300nM构成混合引物体系；G13D上游引物200nM-500nM与延伸阻滞引物300nM构成单独的引物体系；这三类引物体系也均加入有UNG酶0.2U，2×SYBR Green Mastermix10μl，ddH2O补足体积20μl。

5.根据权利要求1至4任一所述的体外准确检测KRAS基因突变的方法，其特征在于：步骤（3）中的扩增参数为：50℃，2~5min；95℃，12~15min；95℃，8~10sec；60℃，8~10sec；65℃，8~10sec；50~55个循环。