[发明专利]一种分离纯化达托霉素的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种分离纯化达托霉素的方法。

背景技术

达托霉素是从玫瑰孢链霉菌发酵液中提取得到的环脂肽类物质，最初是由美国Lily公司于80年代开发，1997年11月，Lily公司将达托霉素的全球独家开发、生产及销售权转让给Cubist制药公司，2003年9月12日，FDA首次批准Cubicin(Daptomycin注射剂)上市。它是获准上市的首个环脂肽类抗生素药物，用于治疗由一些革兰氏阳性敏感菌株引起的并发性皮肤及皮肤结构感染。2006年在澳大利亚，德国，荷兰，西班牙，英国上市，2007年在瑞士上市。随后在加拿大，韩国，欧盟等10多个国家注册。2006年3月美国FDA又批准了达托霉素的新的适应症——用于治疗对甲氧西林敏感的金葡菌(MSSA)或耐甲氧西林金葡菌(MRSA)性菌血症及其引起的右侧心内膜炎。

作为近四十年开发的仅有两类新结构抗生素之一，2000年Pfizer公司研发的利奈唑烷(linezolid)上市不到一年就出现交叉耐药菌的报道。达托霉素具有可以赋予其临床优势的数项独特性质。首先，它的作用机制与现已上市的各类抗菌药物都不相同，这意味着达托霉素将不会受到来自其它抗生素所致交叉耐药性的影响，达托霉素作为应用到临床的首个环脂肽类抗生素，至今尚未有交叉耐药菌的报道，临床耐药菌株的出现几率极低(<0.2%)。其次，达托霉素已经显现能在体外迅速抑制大多数临床重要革兰阳性球菌，包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐万古霉素粪肠球菌和耐万古霉素金黄色葡萄球菌。第三，与传统抗生素至少一日2次给药相比，达托霉素仅需一日1次用药，剂量方案明显简化并可有效降低医疗成本支出。基于上述诸因素，据统计，此药上市后第一年即取得约6000万美元的收入，2006年的销售额较2005年涨幅是68%；2009销售额5～6亿美元。而且在以后数年还有上升潜力，市场前景广阔。

目前，卡比斯特制药公司掌握全球独家开发、生产及销售权，国内也有多家机构正在研究，但现有的纯化水平仍然较低。现有技术关于达托霉素的纯化方法的报道，纯度均在98%以下，且操作复杂。

美国卡比斯特制药公司申请的中国专利CN1404487中通过交替使用阴离子交换色谱、疏水相互作用色谱和阴离子交换色谱进行反复纯化，最后制得色谱纯度大于98%的达托霉素。另一篇卡比斯特制药公司专利CN201010578392.1纯度95%。

丹麦的埃克斯利亚制药有限公司申请的中国专利CN201080008292.3使用阴离子交换色谱柱和反向色谱柱进行纯化，最终纯度95%。中国专利200910058577.7使用阴离子和C4反向硅胶复合物作为复合型反向硅胶柱进行纯化，所报道的达托霉素纯度98.64%。中国专利CN201010196247.7采用凝胶型弱阴离子树脂进行纯化，所报道的达托霉素纯度98%。

发明内容

本发明的目的是提供一种分离纯化达托霉素的方法。该方法克服了达托霉素现有的提取技术的不足，提高了达托霉素的纯度，从而提供一种能够工业化纯化达托霉素的方法。

本发明主要包括如下步骤：

1）陶瓷膜过滤达托霉素发酵液；

2）大孔吸附树脂柱层析；

3）纳滤浓缩；

4）疏水树脂柱层析第一步粗分；

5）离子交换树脂柱层析；

6）疏水树脂柱层析第二步粗分；

7）超滤；

8）冷冻干燥。

具体地包括如下操作步骤：

1）陶瓷膜过滤达托霉素发酵液

用纯化水或5%～30%的乙醇溶液将发酵液稀释，控制料液温度范围20～40℃进行陶瓷膜过滤，

当过滤至陶瓷膜未透过液体积为发酵液初始体积的30%～35%时，对陶瓷膜未透过液进行清洗。清洗方式有两种：

第一种方式，向发酵液中加纯化水5L，加完纯化水后循环5分钟后开始收集陶瓷膜透过液；当发酵液再次浓缩到初始体积的35%左右时继续向发酵液中加入纯化水5L，如此循环，直到加入的纯化水总体积和发酵液初始总体积相等或HPLC检测陶瓷膜透过液中达托霉素单位小于50mg/L时，陶瓷膜过滤结束，收集陶瓷膜透过液。

第二种方式，连续向发酵罐中加入纯化水，调节流速使发酵液暂存罐中液位保持不变，直到加入的纯化水总体积和发酵液初始总体积相等或HPLC检测陶瓷膜透过液中达托霉素单位小于50mg/L时，陶瓷膜过滤结束，收集陶瓷膜透过液。

2）大孔吸附树脂柱层析