[发明专利]具有抗凋亡和细胞增殖调控特性的细胞株及其建立方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞工程技术领域，涉及一种经多基因代谢工程改造的HEK293细胞株。具体地说，它是一种通过组成型过表达腺病毒抗凋亡基因E1B-19K和诱导表达人细胞周期控制基因p27^Kip1，具有改善了体外培养和重组蛋白生产特性的HEK293细胞株及其建立方法。 

背景技术

哺乳动物细胞可进行复杂的翻译后修饰、保持重组蛋白的生物学活性，是目前生物制药产业最广泛采用的表达系统。但是，哺乳动物细胞表达系统的缺点也很明显，主要表现在：细胞生长速率较慢、最终细胞密度较低、蛋白表达水平较低以及细胞凋亡的普遍存在等，在一定程度上影响了它的广泛应用。 

近年来，随着对细胞代谢途径和调控机理的深入研究，越来越多的细胞工程研究者开始利用代谢工程的方法对细胞自身的遗传特性进行有目的的修饰，对细胞的性状进行改良，使其适应能力更强，具备在体外培养条件下的自身调节能力，从而适应生物制药产业大规模培养的要求。目前，动物细胞的代谢工程已应用于增强细胞抗凋亡能力、控制细胞增殖速率、改变细胞的能量代谢途径、改善重组蛋白的糖基化等方面。其中，针对细胞抗凋亡能力和增殖控制两方面性状的改良应用最为广泛、成效最为显著。 

用于提高工程细胞抗凋亡特性的基因主要是bcl-2家族的成员(bcl-2和bcl-xL)及其病毒同源基因(BHRF-1、KSBcl-2和E1B-19K等)，已在杂交瘤、BHK、CHO和COS细胞等多种工程细胞系中显示了显著的抗凋亡作用。其中，E1B-19K是来源于腺病毒的抗凋亡基因，其作用机制可能是通过与促凋亡蛋白Bax相互作用，以及结合Bak蛋白并抑制其加速凋亡进程的功能。在NS0、CHO和BHK细胞中过表达E1B-19K显示了有效降低细胞凋亡、延长培养时间的作用，在某些研究中还观察到了重组蛋白产率的提高。对于HEK293细胞的抗凋亡改造，目前只有一篇文献报道，采用人X-连锁的凋亡蛋白抑制因子(XIAP)、来自牛痘病毒的细胞因子响应修饰蛋白(CrmA)及二者的突 变体分别转染HEK293细胞，在不同凋亡诱导条件下的考察结果表明，四者均使细胞活力显著提高，其保护效果对不同的诱导因素具有一定的特异性。 

在生物反应器中细胞密度达到理想值时，借助分子生物学手段来控制细胞增殖，以提高重组蛋白产率和减少因细胞过度增殖所致的细胞凋亡是提高重组蛋白产量和质量的有效途径。周期蛋白依赖性激酶抑制因子(CKI)在细胞周期进展的调控中发挥极其重要的作用，通过抑制周期蛋白依赖性激酶(CDK)的活性而诱导生长阻滞。其中的p21Cip1和p27^Kip1是目前关于细胞增殖控制的代谢工程中应用最多的两种CKI。共表达SEAP和p21Cip1的瞬时转染CHO细胞系表现出明显的生长阻滞和产量提高5倍，而稳定转染细胞未观察到产量增加。Fussenegger等通过与分化因子CAATT/增强子结合蛋白α(C/EBPα，起到诱导和稳定p21Cip1的作用)和抗凋亡蛋白bcl-xL共表达，成功构建了p21Cip1上调的CHO细胞系，SEAP产量提高了10-15倍，而p27^Kip1与C/EBPα和Bcl-xL同时过表达使SEAP表达提高30倍。 

细胞增殖控制基因的表达需要进行严格的调控，因此控制增殖技术的一个关键问题就是外源基因表达调控系统的选择。目前已较成熟的一些基因调控系统，如四环素、IPTG、蜕皮激素等响应的调控系统已应用在增殖控制中。但是，在制药工业中，使用具有生理活性的小分子诱导剂仍是不允许的，这就限制了增殖控制技术在中试规模的应用。本发明利用中国发明专利201110228457.4建立的一种基于枯草芽孢杆菌生物素连接酶的生物素诱导表达系统进行细胞周期控制基因的诱导表达，该系统采用的诱导剂生物素是获批用于生物制药工业的细胞培养基的基本组分之一，绝对无毒，价格低廉，并且未观察到生物素的存在与否对细胞生长和产物表达具有明显影响。 

发明内容

本发明的目的是提供一种经多基因代谢工程改造的HEK293细胞株18-HEP。具体地说是一种通过组成型过表达E1B-19K和诱导表达p27^Kip1而具有抗凋亡和增殖调控特性的HEK293细胞株。 

本发明的另一个目的是提供用于上述HEK293细胞株多基因代谢工程改造的E1B-19K基因和p27^Kip1基因的序列，其具有序列表中SEQ  No.1和SEQ No.2所述的序列。