[发明专利]具有抗凋亡和细胞增殖调控特性的细胞株及其建立方法

权利要求书

1.一种具有抗凋亡和细胞增殖调控特性的细胞株，其特征在于，所述细胞株是在HEK293细胞中组成型过表达腺病毒抗凋亡基因E1B-19K，所述腺病毒抗凋亡基因E1B-19K的序列如序列表中SEQ ID No.1所示，该细胞株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2012年5月31日，保藏编号为CGMCC No.6176。

2.如权利要求1所述的具有抗凋亡和细胞增殖调控特性的细胞株，其特征在于，所述细胞株还在HEK293细胞株中诱导表达人细胞周期控制基因p27^Kip1，使该细胞在诱导表达条件下发生增殖阻滞，细胞生长显著变慢，所述人细胞周期控制基因p27^Kip1的序列如序列表中SEQ ID No.2所示。

3.如权利要求2所述的具有抗凋亡和细胞增殖调控特性的细胞株，其特征在于，所述诱导表达基因p27^Kip1，是采用基于枯草芽孢杆菌生物素连接酶、响应于生物素的诱导表达系统。

4.权利要求1-3中任意一项所述具有抗凋亡和细胞增殖调控特性的细胞株的建立方法，其特征在于，所述方法步骤如下：

a.E1B-19K和BS-BV组成型共表达载体的构建：

利用序列如SEQ ID No.3~16所示的引物，通过重叠PCR获得E1B-19K基因，其序列如SEQ ID No.1所示；经Not I/Mlu I酶切后，连入同样经Not I/Mlu I酶切的pBudCE4.1载体的EF-1α启动子下游；用Afl II/Not I从pc-BS-BV载体上酶切获得BS-BV基因，补平，连入经Afl II/EcoR I酶切并补平的pBud-E1B载体CMV启动子下游，得到同时组成型独立表达E1B-19K基因和BS-BV基因的载体，命名为pBud-E1B-BS-BV；

b.响应于生物素的p27^Kip1诱导表达载体的构建：

利用SEQ ID No.17及SEQ ID No.18所示引物从商业化载体pCMV-SPORT6-p27上扩增得到p27^Kip1cDNA片段，Nhe I/BamH I酶切，连入同样酶切的pc-Hy-4BSOB-minCMV载体，得到响应于生物素的p27^Kip1诱导表达载体pc-Hy-4BSOB-minp27；

c.细胞转染及筛选：

将上述两载体pBud-E1B-BS-BV和pc-Hy-4BSOB-minp27共转染HEK293细胞，经200μg/mL Zeocin和400μg/mL G418筛选两周，得到阳性混合克隆细胞。将上述混合克隆通过有限稀释法进行单克隆化，按3cells/孔接种于96孔细胞培养板中，置于37℃，5%CO₂培养，约两周后，将单克隆孔消化传代，扩大培养，用于后续实验。

5.一种用于建立权利要求1-3中任意一项所述具有抗凋亡和细胞增殖调控特性的细胞株的表达载体pBud-E1B-BS-BV，其特征在于，其序列如序列表中SEQ ID No.19所示。

6.一种用于建立权利要求1-3中任意一项所述具有抗凋亡和细胞增殖调控特性的细胞株的表达载体pc-Hy-4BSOB-minp27，其特征在于，其序列如序列表中SEQ ID No.20所示。

7.一组用于建立权利要求1-3中任意一项所述具有抗凋亡和细胞增殖调控特性的细胞株的重叠PCR引物，其特征在于，所述引物的序列分别如SEQ ID No.3~16所示。

8.如权利要求7所述的一组重叠PCR引物，其特征在于，序列如SEQ ID No.3和No.4所示的引物、如SEQ ID No.5和No.6所示的引物、如SEQ ID No.7和No.8所示的引物、如SEQ ID No.9和No.10所示的引物、如SEQ ID No.11和No.12所示的引物、如SEQ ID No.13和No.14所示的引物、如SEQ ID No.15和No.16所示的引物，分别构成引物对。

9.权利要求1-3中任意一项所述的具有抗凋亡和细胞增殖调控特性的细胞株在重组蛋白生产方面的应用。