[发明专利]一种用于基于焦磷酸原理的454高通量测序的emPCR方法

权利要求书

1.一种用于基于焦磷酸原理的454高通量测序中emPCR的方法，其包括步骤：

1)乳化油、emPCR扩增混合液和试剂准备；

2)DNA文库捕获；

3)乳化；

4)扩增；

5)磁珠回收；

6)DNA文库磁珠富集；

7)测序引物退火，即制得测序所用的emPCR产物；

其特征在于，步骤1)所述的emPCR扩增混合液包括下列各组分：emPCRAdditive，30.6％～43.0％(v/v)；5×扩增液，18.4％～21.5％(v/v)；扩增引物，2.0％～7.5％(v/v)；emPCR酶混合液，2.6％～5.9％(v/v)；PPiase，0.1％～0.3％(v/v)；余量为水。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述的emPCR扩增混合液包括下列各组分：emPCR Additive，38.4％(v/v)；5×扩增液，20.3％(v/v)；扩增引物，4.8％(v/v)；emPCR酶混合液，5.3％(v/v)；PPiase，0.2％(v/v)；余量为水。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的emPCR扩增混合液的总体积为930μL～980μL。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的emPCR扩增混合液的总体积为937μL，包括下列各组分：360μL emPCRAdditive；180～200μL 5×扩增液；35～55μL扩增引物；50μL emPCR酶混合液；2μL PPiase；余量为水。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的emPCR扩增混合液的总体积为937μL，包括下列各组分：290μL超纯水；360μL emPCRAdditive；190μL5×扩增液；45μL扩增引物；50μLemPCR酶混合液；2μL PPiase。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)所述扩增的反应程序为：

①90-95℃，3-6min；

②93-95℃，28-32s；

③57-59℃，4-5min；

④66-70℃，28-32s；

步骤②至④共45-55个循环；

⑤4-10℃保存。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述扩增的反应程序中步骤②至④为：

②94-95℃，28-32s；

③57-58℃，4-5min；

④67-69℃，28-32s。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述扩增的反应程序中步骤①为94℃，4min；步骤⑤为10℃保存。

9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述扩增的反应程序为：

①94℃，4min；

②94℃，30s；

③58℃，4.5min；

④68℃，30s；

步骤②至④共50个循环；

⑤10℃保存。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的高通量测序为基于焦磷酸原理的454高通量转录组测序。