[发明专利]一种提高桑黄总三萜类化合物产量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种提高桑黄总三萜类化合物产量的液体发酵方法，属于生物发酵工程技术领域。

背景技术

桑黄(Phellinus igniarius)为担子菌亚门Basidiomycotina、层菌纲Hymenomycetes、多孔菌目Polyporales、锈革孔菌科Hymenochaetacae、针层孔菌属(Phellinus)真菌，是一种珍贵的大型药用真菌。传统中医认为桑黄性甘、味苦，用于治疗血崩、带下、闭经、脾虚泄泻等。现代药理学研究表明，桑黄具有抗肿瘤、增强免疫力、抗肝纤维化等功效。据报道，桑黄是目前抗肿瘤能力最高的药用真菌。早在1968年，日本学者Tetsuro Ikekawa等用桑黄的水提取物进行细胞试验，结果发现其对小鼠S180的抑制率为96.7％，而对正常细胞无毒，同时研究发现桑黄主要活性成分为多糖组分、三萜类化合物和黄酮类物质，其中所含三萜类涵盖了不下百余种的化合物成分，其中以四环三萜类化合物为主。近来研究表明桑黄中的三萜类物质具有迅速提高免疫力的作用，表现在促进淋巴细胞增殖，提高巨噬细胞、NK细胞、T细胞的吞噬能力和杀伤力，并直接和间接毒杀肿瘤细胞，同时能够激活化疗药物难以杀死的休眠期肿瘤细胞，进行单独和联合毒杀。由于桑黄三萜类化合物对休眠期细胞的独特作用，以及对恶性肿瘤复发转移的有效遏止，弥补了传统肿瘤治疗(手术、放疗、化疗)的不足，成为肿瘤免疫治疗中的重要成分。但是桑黄的总三萜类化合物产量较低一直是限制其应用的影响因素，由于受生理状态的特殊性、复杂性以及外部环境的制约，特别是生成可应用的子实体需要多年，加之近几年人们对野生桑黄的大量采集，天然的桑黄资源已经非常稀少，同时桑黄的人工栽培也极其困难，培养条件苛刻，且生长周期长达3～4年。因此，仅是通过利用采集或人工栽培子实体从中提取总三萜类化合物的生产方式很难满足日益膨胀的市场需要。液体发酵法生产桑黄的有效成分有生产周期短、节省劳动力、受外部环境影响小等优点，是一种相对低成本、高效的生产方法，但其中总三萜类成分的分泌产量仍然较低。

目前，国内外学者对桑黄总三萜类化合物的发酵研究相对较少，主要集中在培养基组成、溶氧、pH值及产物提取分离等工艺层面上，对桑黄总三萜类化合物的发酵水平提高有限，还远不能满足现代工业化发酵生产的需要。

近年来，在植物细胞壁中发现一类被称为扩张蛋白的蛋白新家族。自McQueen-Mason等首先从黄瓜下胚轴伸长区分离纯化出扩张蛋白以来，相继从燕麦胚芽鞘细胞壁、栝楼根尖细胞壁、番茄、烟草、拟南芥、水稻、棉纤维、玉米、大豆等细胞壁中也发现了扩张蛋白的存在，被认为其普遍存在于各种双子叶和单子叶植物的细胞壁中，促进其细胞生理生长，影响营养生长、形态发生、授粉受精、果实软化等。通过重组细胞壁实验研究证实了该蛋白与以前发现的所有细胞壁蛋白不同，它具有诱导热钝化的离体细胞壁恢复伸展的功能，被推测能够打断细胞壁多聚物之间的氢键进而诱导酸依赖的细胞壁延展和压力松弛等生理活动，在植物生长过程中可能是生理调控和细胞壁松弛延伸的主要调控因子。但是，关于扩张蛋白的作用机制目前仍多是猜测和推断，国内外均未有明确的验证定论和机制阐明。因此，对扩张蛋白的各种应用的研究报道很少，将扩张蛋白应用于桑黄的液体发酵生产，用以提高桑黄三萜类化合物等次生代谢产物的产量的研究国内外均尚未见报道。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种利用扩张蛋白提高桑黄总三萜类化合物产量的液体发酵方法。

本发明的技术方案如下：

一种提高桑黄总三萜类化合物产量的液体发酵方法，包括如下步骤：

(1)将桑黄菌种接种到平板培养基上，进行活化培养，然后取菌块接种于液体发酵培养基中进行发酵培养，液体发酵培养条件为：温度22～27℃，摇床培养2～3天，摇床转速100～180r/min，得初发酵液；

(2)向步骤(1)制得的初发酵液中加入扩张蛋白溶液，使扩张蛋白的浓度为0.2～1.5mg/ml，然后在温度22～27℃、摇床转速100～180r/min的条件下，继续培养3～5天，分离，得到桑黄菌丝体和发酵液；

(3)从步骤(2)制得的发酵液中提取桑黄胞外总三萜类化合物，从步骤(2)制得的桑黄菌丝体中提取桑黄胞内总三萜类化合物，混合桑黄胞外总三萜类化合物和胞内总三萜类化合物，即得桑黄总三萜类化合物。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中的平板培养基为PDA平板培养基；每升组分如下：

马铃薯200g、葡萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水定容至1000mL。