[发明专利]一种提高桑黄总三萜类化合物产量的方法

权利要求书

1.一种利用扩张蛋白提高桑黄总三萜类化合物产量的液体发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将桑黄菌种接种到平板培养基上，进行活化培养，然后取菌块接种于液体发酵培养基中进行发酵培养，液体发酵培养条件为：温度22～27℃，摇床培养2～3天，摇床转速100～180r/min，得初发酵液；

(2)向步骤(1)制得的初发酵液中加入扩张蛋白溶液，使扩张蛋白的终浓度为0.2～1.5mg/ml，然后在温度22～27℃、摇床转速100～180r/min的条件下，继续培养3～5天，分离，得到桑黄菌丝体和发酵液；

(3)从步骤(2)制得的发酵液中提取桑黄胞外总三萜类化合物，从桑黄菌丝体中提取桑黄胞内总三萜类化合物，混合桑黄胞外总三萜类化合物和桑黄胞内总三萜类化合物，即得桑黄总三萜类化合物。

2.如权利要求1所述的液体发酵方法，其特征在于，所述步骤(1)中的活化培养条件为：温度22～27℃，时间4～5天。

3.如权利要求1所述的液体发酵方法，其特征在于，所述步骤(2)中，扩张蛋白的浓度为0.3～1.0mg/mL；进一步优选0.35～0.8mg/mL；最优选扩张蛋白的浓度为0.4mg/mL。

4.如权利要求1所述的液体发酵方法，其特征在于，所述步骤(2)中的扩张蛋白溶液的制备方法如下：

将大豆或黄瓜种子经0.05～0.15wt％ HgCl₂消毒4～6min，流水冲洗5～7h，然后，25～28℃暗培养4～6天；剪取幼苗下胚轴顶端3～4cm，置-20℃预冷0.5h，加预冷至4℃的匀浆缓冲液，匀浆后，用孔径70μm的尼龙网过滤，滤渣经匀浆缓冲液洗涤，然后将滤渣加入匀浆缓冲液中，室温静置1～3h，得静置液；向静置液中加入提取液，4℃下提取44～50h，过滤，按0.3～0.5g/mL的添加量向滤液中缓慢添加(NH₄)₂SO₄，添加(NH₄)₂SO₄过程中不断搅拌，防止(NH₄)₂SO₄局部过饱和，然后静置45～50h，4℃条件下25000g离心5～10min，沉淀用酸性缓冲液复溶，4℃下分子量3000Da的透析袋透析，透析液经20000g离心10min，取上清液即为制备的扩张蛋白溶液。

5.如权利要求4所述的液体发酵方法，其特征在于，所述匀浆缓冲液组分为：25mmol/L4-羟乙基哌嗪乙磺酸，1.5mmol/L Na₂S₂O₅，2mmol/L乙二胺四乙酸，0.1wt％ Triton X-100，pH 7.0。

6.如权利要求4所述的液体发酵方法，其特征在于，所述提取液组分为：15mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，1.0mmol/L乙二胺四乙酸，1.5mmol/L Na₂S₂O₅，0.5mol/L NaCl，pH 6.0。

7.如权利要求4所述的液体发酵方法，其特征在于，所述酸性缓冲液每升按如下方法配制：

将2.05g醋酸钠溶于水中，用冰醋酸调节pH至4.0，水定容至1L。

8.如权利要求1所述的液体发酵方法，其特征在于，所述步骤(2)中的分离，是指在15000r/min条件下离心分离5～10min。

9.如权利要求1所述的液体发酵方法，其特征在于，所述步骤(3)中提取桑黄胞外总三萜类化合物的步骤如下：

向步骤(2)制得的发酵液中加入3～5倍体积的体积百分数为95％的乙醇溶液，去除沉淀，取上清液，经70℃浓缩蒸馏去除乙醇，然后加入2～3倍体积的乙酸乙酯萃取，再经过70℃浓缩蒸馏去除乙酸乙酯，得到胞外总三萜类化合物。

10.如权利要求1所述的液体发酵方法，其特征在于，所述步骤(3)中提取桑黄胞内总三萜类化合物的步骤如下：

将步骤(2)制得的桑黄菌丝体65℃烘干，研成粉末，按每克桑黄菌丝体粉末加15～40mL甲醇的量加入甲醇，在室温条件下，通过频率40KHz，功率200W的超声提取5～7h，过滤，取上清液，制得浸提液；滤渣重复超声提取、过滤操作，合并浸提液，经65℃浓缩蒸馏去除甲醇，得到桑黄胞内总三萜类化合物。