[发明专利]一株高产乙酸酯酿酒酵母工程菌

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及工业微生物的育种，尤其是一株高产乙酸酯酿酒酵母工程菌。

背景技术

黄酒和白酒是我国的特色酒种，国内普通白酒和黄酒是以纯种培养的酿酒酵母为主进行发酵的，其特点是发酵周期短、原料出酒率高，但由于酿酒酵母产酯香物质的能力极低，致使成品酒品质较差。高档饮料酒(黄酒、白酒)酯香物质含量较高的主要原因是采用自然网罗微生物制曲发酵，通过自然制曲网罗的产酯能力较强的汉逊酵母和假丝酵母等生香微生物来提高酒中酯含量，而这些野生酵母的存在严重影响原料出酒率，其酒精发酵效率不到酿酒酵母的三分之一，因而导致我国高档白酒和黄酒耗粮高、生产周期长、效率低、成本高。

如何提高酒中酯香物质的含量，一直是我国普通白酒、黄酒企业和相关科研单位研究的重要课题。但是，目前国内提高酒中酯香物质含量的方法仍存在很多问题。因此，要从根本上解决酿酒酵母的产酯能力还是需要利用分子生物学育种技术构建高产酯的酿酒酵母工业菌株。

研究表明，乙酸酯类，如乙酸乙酯(溶剂类香气)，乙酸异戊酯(香蕉风味)和乙酸异丁酯(成熟水果香)，是酒中主要的风味活性酯。这些酯类的形成是在酵母代谢时在酵母内合成的，形成的酯一部分通过细胞扩散到发酵液中，一部分被酵母吸附，留在细胞体内。提高这些乙酸酯的含量不仅可以增进酒的酯香，同时能有效地扩张、松驰神经，可减少喝酒引起的副作用。

参与乙酸酯合成的酶主要是醇乙酰基转移酶(AATase)，该酶催化醇和乙酰辅酶A形成乙酸酯。该酶是一种巯基酶，有三种不同的类型：AATase I、Lg-AATase I和AATase II，分别由ATF1、Lg-ATF1和ATF2编码。而国内还没有醇乙酰基转移酶及其编码基因对白酒和黄酒风味和品质影响的相关研究。

发明内容

本发明的目的是解决酿酒酵母自身产酯能力较低的问题，提供一株高产乙酸酯酿酒酵母工程菌株。

本发明提供的高产乙酸酯酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，具体为EY-14，已于2011年12月22日保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心，地址：中国北京市朝阳区大屯路甲3号，保藏号为CGMCC No 5635。

该酿酒酵母在其它发酵性能不受影响的情况下，模拟半固态发酵后，转化子菌株与亲本菌株(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No 2.1525)相比，乙酸乙酯含量提高3.6倍，乙酸异戊酯的含量提高到55.2mg/L，乙酸异丁酯含量提高到33.8mg/L。

本发明高产乙酸酯酿酒酵母工程菌株的构建方法包括：

1)将PGK1启动子和终止子与pUC19质粒连接得到pUC-P；

2)将来源于酿酒酵母的同源片段IAH连接到第1)步得到的pUC-PGK1上，得到pUC-PGK1-IAH；

3)将编码醇乙酰基转移酶ATF2基因插入到第2)步得到的pUC-PGK1-IAH中的PGK1启动子和终止子之间，得到pUC-PGK1-IAH-ATF2；

4)将kan基因连接到第3)步得到的pUC-PGK1-IAH-ATF2上，得到质粒pUC-PGK1-IAH-ATF2-kan(以下简称pUC-PIA2K)；

5)将第4)步构建的过表达质粒pUC-PIA2K用Bpu1102I酶切，用醋酸锂转化法分别将其插入酿酒酵母a型和α型单倍体，得到同源重组后的酿酒酵母基因工程单倍体菌株，

6)将纯化后的酿酒酵母a型和α型重组单倍体进行融合，通过抗性平板和生孢实验筛选得到高产乙酸酯酿酒酵母工程菌(双倍体)。

本发明同时提供了一种专门用于鉴定所述高产乙酸酯的酿酒酵母工程菌的基因序列，该基因序列是以ATF-U和ATF-D为引物，以所述高产乙酸酯的酿酒酵母工程菌菌株基因组为模板，扩增片段测序为一特异性序列，如序列表1所示。

模拟半固态发酵：将酵母菌接入5mL麦芽汁培养液中，30℃过夜培养12h；将菌液全部转至20mL新鲜麦芽汁培养液中，30℃培养24h。取100g粳米置于25～30℃的水中，浸渍72h；取出后洗净，常压蒸煮30min。将米摊凉，投入500mL三角瓶中，加入10g熟麦曲和105mL水。最后，接入25mL酵母麦芽汁培养液，28℃发酵5天。对发酵液进行分析，包括失重、酒度、残糖和GC测定香气成分含量。